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文檔簡介
1、聚酮類化合物(polyketide,PK)和非核糖體多肽(nonribosomal peptide,NRP)是兩類重要的次級代謝產(chǎn)物,在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用。面對日益嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥性問題、新疾病危害和環(huán)境污染,尋找具有新結(jié)構(gòu)、新生物活性的化合物成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。理論研究表明,自然界尚有大量未發(fā)現(xiàn)的PK和NRP。然而,由于受已發(fā)現(xiàn)化合物的干擾,運(yùn)用傳統(tǒng)的化合物分離手段分離獲得新化合物的幾率降低。高通量篩選或其他效率更高
2、的化合物篩選方法受到國內(nèi)外學(xué)者的青睞。本研究采用PCR擴(kuò)增和基因組測序的方法,獲得菌株P(guān)aenibacillus tianmuensis F6-B70、Paenibacillus elgii B69的編碼PK和NRP生物合成的PKS基因和NRPS基因片段。經(jīng)序列分析,預(yù)測P。tianmuensis F6-B70、P.elgii B69具有產(chǎn)新化合物的能力,并成功分離到新抗生素paenimacrolidin(PAM)和新嗜鐵素paenib
3、actin。在此基礎(chǔ)上,研究了PAM和paenibactin的生物活性,并對paenibactin生物合成基因簇的功能、進(jìn)化及導(dǎo)致基因簇產(chǎn)物多樣性的機(jī)制進(jìn)行了探討。主要研究成果如下:
1、基于PKS、NRPS基因的抗生素PAM研究以P.tianmuensis F6-B70基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得NRPS、PKS基因片段各四條。經(jīng)序列分析,推測P.tianmuensis F6-B70具有產(chǎn)新化合物的能力。對P.tia
4、nmuensis F6-B70的菌體抽提液進(jìn)行分離純化,獲得抗生素PAM。PAM是首個從Paenibacillus屬中分離到的PK,分子量為542Da,分子式為C33H50O6。PAM能抑制包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐氨芐西林表皮葡萄球菌在內(nèi)的葡萄球菌。MIC(Minimum inhibitory concentration)值為16~32μg/mL。PAM在37℃不穩(wěn)定,其MIC值隨孵育時間延長而快速升高。PAM抑菌而非殺菌的作用
5、機(jī)理及不穩(wěn)定的特性影響了PAM的抗菌活性。
2、基于NRPS基因的嗜鐵素paenibactin的分離、純化及鑒定分析P.elgiiB69基因組,獲得NRPS基因簇pae。該基因簇由paeGACEBF6個基因組成。經(jīng)序列分析,預(yù)測pae基因簇參與一種新嗜鐵素的合成,該嗜鐵素由DHB(2,3-dihydroxybenzoate)、Thr、Gly的類似物組成。選用缺鐵培養(yǎng)基誘導(dǎo)P。elgii B69產(chǎn)嗜鐵素。分析發(fā)酵液,發(fā)現(xiàn)嗜鐵
6、素paenibactin。經(jīng)MS、NMR測定,paenibactin分子式為C42H48N6O18,是由三個(DHB-Ala-Thr)單元通過酯鍵連接而形成的三聚物。Paenibactin是首個從Paenibacillus屬中分離并完成結(jié)構(gòu)鑒定的嗜鐵素,其螯合Fe3+的比例為1:1。
3、Paenibactin的生物合成基因簇采用PCR技術(shù)擴(kuò)增paeF-A1片段,將之整合入表達(dá)載體pET-28a,再轉(zhuǎn)化Escherichi
7、a coli BL21(DE3)進(jìn)行異源表達(dá)。體外生化實(shí)驗(yàn)表明:結(jié)構(gòu)域PaeF-A1的特異性底物為Ala,pae基因簇即為paerubactin的生物合成基因簇。在此基礎(chǔ)上,探討了paenibactin的生物合成途徑、paenibactin-Fe3+轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制及被螯合Fe3+的釋放機(jī)制。
4、Paenibactin生物合成基因簇的系統(tǒng)發(fā)生通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,證明pae基因簇是由bacillibactin的生物合成基因簇dhb
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