乳酸菌抗氧脅迫及有氧生長的研究.pdf

1、氧對(duì)乳酸菌的影響因菌株而異，一般體現(xiàn)在正反兩個(gè)方面:乳酸菌是通常被認(rèn)為屬于耐氧型細(xì)菌，抗氧脅迫機(jī)制不完善。環(huán)境中存在的、及在菌株自身代謝過程中產(chǎn)生的O2-，H2O2，HO·等活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)，嚴(yán)重威脅到菌株的生長和生存。降低活性氧的傷害，是影響乳酸菌生物量和菌體存活的關(guān)鍵因素之一;另一方面在氧氣存在的情況下，部分乳酸菌進(jìn)行有氧生長，其生理代謝情況將發(fā)生較大改變，從而帶來最終菌體生物量、發(fā)酵

2、產(chǎn)物等明顯不同于發(fā)酵作用的巨大變化;更為特別的是，有些乳酸菌在有氧條件下，可以進(jìn)行有氧呼吸。對(duì)部分菌株而言，呼吸鏈的激活可能促進(jìn)菌體生長，并減弱活性氧的威脅，提高細(xì)胞的存活力。本論文就乳酸菌抗氧脅迫、有氧生長及有氧呼吸進(jìn)行了研究:
　　 1.氧對(duì)植物乳桿菌生理代謝的影響
　　 Lb.plantarum為少數(shù)幾種大基因組乳酸菌之一，復(fù)雜的遺傳信息決定了其生理代謝的復(fù)雜可變性及在食品發(fā)酵、有機(jī)物轉(zhuǎn)化等多個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值。氧氣

3、對(duì)Lb.plantarum生理代謝的影響具有典型的兩面性，本文對(duì)此進(jìn)行了詳細(xì)研究。在所述實(shí)驗(yàn)條件下，有氧生長的Lb.plantarum能夠達(dá)到更高的菌體密度，最高OD600較之無氧生長高1.8左右;但是，有氧生長的Lb.plantarum在達(dá)到生長峰值以后即開始迅速死亡，24小時(shí)以后即幾乎不能檢測到活菌的存在。隨后，對(duì)兩種不同培養(yǎng)條件下葡萄糖的消耗及乳酸、乙酸的產(chǎn)生進(jìn)行了比較:兩種生理狀態(tài)的Lb.plantarum均能在9小時(shí)內(nèi)消耗完主

4、要碳源——葡萄糖，并產(chǎn)生大量乳酸、乙酸。不同的是，有氧生長的Lb.plantarum隨后可以將部分乳酸轉(zhuǎn)化為乙酸，利用該過程產(chǎn)生的能量得以繼續(xù)生長;而無氧生長的Lb.plantarum則不存在這一過程，葡萄糖耗盡時(shí)即生長停止。這解釋了Lb.plantarum在有氧生長時(shí)，為何能夠達(dá)到較高菌體密度。另一方面，乳酸-乙酸轉(zhuǎn)化過程中，在NADH氧化酶及丙酮酸氧化酶的作用下利用氧氣產(chǎn)生H2O2，高量積累而得不到降解的H2O2與Lb.planta

5、rum細(xì)胞在12小時(shí)即開始迅速死亡的現(xiàn)象必然存在重要聯(lián)系。如何充分利用有氧生長獲取高密度的菌體細(xì)胞，而又保持其菌活性對(duì)于Lb.plantarum在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用具有重要的意義。
　　 2.乳酸在植物乳桿菌氧脅迫中的關(guān)鍵作用
　　 在以豐富葡萄糖為碳源進(jìn)行有氧生長時(shí)，Lb.plantarum產(chǎn)生大量的H2O2及乳酸，高濃度的H2O2被認(rèn)為是導(dǎo)致菌株在到達(dá)穩(wěn)定期后即迅速死亡的主要原因。然而體外實(shí)驗(yàn)表明，5mM的H2O2單獨(dú)

6、處理并不能造成Lb.plantarum細(xì)胞迅速死亡，本文對(duì)其他代謝物在菌株死亡中的作用進(jìn)行研究。乳酸被認(rèn)為通過降低體系pH、解構(gòu)胞內(nèi)含鐵蛋白、與Fe3+結(jié)合形成乳酸-鐵復(fù)合物等方式，在催化高毒性O(shè)H·生成的Fenton類反應(yīng)中起到重要作用。本章通過乳酸及H2O2單獨(dú)或共同處理穩(wěn)定期Lb.plantarum細(xì)胞，證明只有乳酸及H2O2的共同作用才能造成Lb.plantarum迅速死亡;乙酸、鹽酸在與H2O2共同作用時(shí)，菌株存活率分別為73

7、.8％，72.9％，而乳酸與H2O2共同處理時(shí)細(xì)胞存活率僅為15.1％，推測乙酸、鹽酸只能通過降低pH，在一定程度上提高菌株的死亡率;而通過二乙三胺五乙酸、鄰菲羅啉等鐵螯合劑除去處理體系中游離的鐵離子，能夠有效降低乳酸和H2O2造成的氧脅迫從而提高菌株存活率，進(jìn)一步證明了乳酸菌產(chǎn)生的乳酸與Fe3+結(jié)合，催化H2O2經(jīng)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生高反應(yīng)活性的OH·，對(duì)細(xì)胞造成嚴(yán)重殺傷的作用方式。
　　 3.內(nèi)源性過氧化氫酶對(duì)植物乳桿菌的保

8、護(hù)
　　 Lb.plantarum基因組中含有編碼血紅素依賴的過氧化氫酶基因，在培養(yǎng)基中添加血紅素的情況下，該內(nèi)源性過氧化氫酶被激活。有氧培養(yǎng)過程中，雖然外源添加過氧化氫酶能夠在短時(shí)間內(nèi)迅速降解環(huán)境中的H2O2，但是由于胞外環(huán)境不穩(wěn)定，特別是不斷降低的pH值必將影響酶的活性，24小時(shí)后酶活性基本喪失而菌株亦開始迅速死亡。與外源添加的過氧化氫酶相比，內(nèi)源過氧化氫酶定位于細(xì)胞內(nèi)，環(huán)境pH值、離子濃度等都較為恒定，作用環(huán)境更加溫和，在

9、整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，內(nèi)源過氧化氫酶激活的Lb.plantarum能夠一直保持高存活率。
　　 4.植物乳桿菌及短小乳桿菌的有氧呼吸
　　 全基因組信息分析表明，Lb.plantarum及Lb.brevis具有呼吸鏈的部分功能元件。有氧條件下，外源添加血紅素和甲基萘醌，Lb.plantarum能夠啟動(dòng)呼吸鏈并進(jìn)入有氧呼吸的生理狀態(tài)。綠色熒光蛋白的發(fā)光強(qiáng)度與胞內(nèi)分子氧濃度有關(guān)，通過比較綠色熒光蛋白在胞內(nèi)發(fā)光強(qiáng)度，證明有氧呼吸能夠

10、使胞內(nèi)保持較低的氧濃度。與有氧生長相比，進(jìn)行有氧呼吸時(shí)，培養(yǎng)基中葡萄糖耗盡后，Lb.plantarum能夠更迅速的將乳酸轉(zhuǎn)化為乙酸，發(fā)酵結(jié)束以后體系中乳酸含量更低而乙酸含量更高。與研究較為透徹的乳酸乳球菌相比，Lb.plantarum的有氧呼吸具有獨(dú)特的特點(diǎn)。雖然通過更多的乳酸-乙酸轉(zhuǎn)化，有氧呼吸狀態(tài)的Lb.plantarum能夠獲取更多能量，但也將積累更多的H2O2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Lb.plantarum進(jìn)行有氧呼吸時(shí)，所達(dá)到的最高生

11、物量與有氧生長時(shí)無顯著差別。盡管添加血紅素和甲基萘醌后，Lb.plantarum始終能夠保持高細(xì)胞活性，但是單獨(dú)添加血紅素也能取得類似的結(jié)果。通過構(gòu)建過氧化氫酶基因缺失的Lb.plantarum菌株，并檢測其在添加血紅素和甲基萘醌的情況下的存活率，最終證實(shí):高細(xì)胞活性的保持主要得益于內(nèi)源性過氧化氫酶的激活，而不是有氧呼吸的生理狀態(tài)。Lb.brevis具有與Lb.plantarum相類似的呼吸鏈組成，能夠進(jìn)行有氧呼吸，但二者在有氧呼吸的表

12、型方面存在著諸多差異，這是由兩種菌株不同的代謝類型造成的。進(jìn)行有氧呼吸時(shí)Lb.brevis能夠達(dá)到更高的生物量，細(xì)胞存活性也保持最高，說明有氧呼吸對(duì)該菌株的搞生物量生產(chǎn)是十分有益的。
　　 5.芽孢桿菌提高乳酸桿菌抗氧脅迫能力
　　 傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，芽孢桿菌通過大量消耗掉消化道內(nèi)的氧氣制造厭氧的環(huán)境，保護(hù)和促進(jìn)乳酸菌的生長，即所謂“生物奪氧學(xué)說”。本文以枯草芽孢桿菌B.subtilis168為研究對(duì)象，探討了腸道環(huán)境中芽孢

13、桿菌對(duì)乳酸桿菌的保護(hù)作用。發(fā)現(xiàn)了另外的可能性，首先驗(yàn)證了B.subtilis168在模擬腸道環(huán)境中所發(fā)生的迅速自裂解現(xiàn)象，并且該菌株的自裂解被膽鹽顯著促進(jìn);發(fā)現(xiàn)在搖動(dòng)培養(yǎng)條件下，當(dāng)培養(yǎng)基中添加B.subtilis168自裂解液時(shí)，Lb.plantarumLA經(jīng)2天培養(yǎng)后的存活性相對(duì)于單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)約提高了109倍，這與B.subtilis168/Lb.plantarumLA活菌混合培養(yǎng)的結(jié)果相類似;與此相對(duì)應(yīng)的是，混合培養(yǎng)物中幾乎檢測不到過

14、氧化氫的存在，而Lb.plantarumLA單獨(dú)搖動(dòng)培養(yǎng)物中，過氧化氫濃度達(dá)到了毫摩爾每升的高水平;鑒于細(xì)胞裂解以后來源于B.subtilis168的過氧化氫酶活性迅速喪失，研究證明Lb.plantarumLA自身過氧化氫酶被B.subtilis168釋放的血紅素有效激活，該酶具有極強(qiáng)的過氧化氫分解能力，可以有效阻止菌體DNA的降解，是菌株存活性顯著提高的主要因素。我們的研究為芽孢桿菌益生機(jī)制提供了新的補(bǔ)充。
　　 6.過氧化氫

15、酶在嗜熱鏈球菌中的高效表達(dá)及對(duì)保加利亞乳桿菌的保護(hù)
　　 保持產(chǎn)品中較高的活菌數(shù)，延長商品的貨架期，是酸奶生產(chǎn)中追求的重要目標(biāo)。然而在酸奶的生產(chǎn)、運(yùn)輸及銷售過程中，氧的接觸難以避免。氧脅迫是威脅S.thermophilus、Lb.bulgaricus等酸奶發(fā)酵劑菌株生存生長的重要因素，由于Lb.bulgaricus可以產(chǎn)生大量H2O2，且較之其他活性氧族，H2O2在環(huán)境中存在時(shí)間較長，所以及時(shí)清除體系中的H2O2可有效保持菌株的

16、存活性。本文從通常認(rèn)為安全的（GenerallyRecagnizedAsSafe，GRAS）的Lb.brevis克隆得到過氧化氫酶基因katE并轉(zhuǎn)化S.thermophilus，實(shí)現(xiàn)了過氧化氫酶的高效表達(dá)。經(jīng)檢測，S.thermophilus重組菌株S.thermophilusST5/pB6katE過氧化氫酶活達(dá)到6.4μmolH2O2min-110-8cfu，接近基因來源菌株Lb.brevis中的水平。對(duì)重組菌株抗氧脅迫能力進(jìn)行了檢測

17、:經(jīng)H2O2暴露處理1小時(shí)后，指數(shù)期及穩(wěn)定期S.thermophilusST5/pB6katE細(xì)胞的存活率分別為對(duì)照菌株S.thermophilusST5/pB6的52及143倍。在長時(shí)間搖動(dòng)培養(yǎng)的綜合氧脅迫下處理4天后，S.thermophilusST5/pB6katE的活菌數(shù)較對(duì)照菌株S.thermophilusST5/pB6提高約2500倍。表明過氧化氫酶的表達(dá)，顯著提高了S.thermophilus抗氧脅迫能力。隨后對(duì)模擬酸奶環(huán)

18、境中，過氧化氫酶重組菌株是否能夠保護(hù)伴侶菌株Lb.bulgaricus對(duì)抗氧脅迫進(jìn)行了研究:指數(shù)期及穩(wěn)定期的Lb.bulgaricusATCC11842與S.thermophilusST5/pB6KatE混合，經(jīng)短時(shí)間H2O2暴露處理后，其存活率分別與對(duì)照菌株S.thermophilusST5/pB6混合時(shí)的18倍及127倍。由此可見，S.thermophilusST5/pB6KatE可以有效保護(hù)Lb.bulgaricus對(duì)抗氧脅迫的危