雷公藤甲素對心肌細(xì)胞周期抑制因子CDKN1a表達(dá)及心肌肥大的影響.pdf

1、哺乳動物的心肌細(xì)胞盡管在胚胎期分裂增殖極為活躍，但在出生后不久即停止分裂增殖，退出細(xì)胞周期。在一些病理因素刺激下，心肌細(xì)胞可重新進(jìn)入細(xì)胞周期，蛋白質(zhì)和核酸合成增多，但一般不發(fā)生分裂，表現(xiàn)為細(xì)胞肥大。心肌肥大(cardiachypertrophy)是高血壓、心瓣膜病等多種心血管疾病的共同并發(fā)癥，是心肌細(xì)胞對心臟長期過負(fù)荷工作的一種代償性反應(yīng)。研究表明，心肌肥大是心衰發(fā)生的獨(dú)立危險因素，抑制心肌肥大能明顯降低心衰的發(fā)生和死亡率。防治與逆轉(zhuǎn)心

2、肌肥大已成為高血壓、慢性心衰等心血管疾病治療的主要目標(biāo)。
　　細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子1a(cyclin-dependent kinase inhibitor1a，CDKN1a)作為細(xì)胞周期的一種重要負(fù)性調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞周期進(jìn)程中起著關(guān)鍵性的作用。就心肌細(xì)胞而言，CDKN1a在成年心臟中呈高表達(dá)，通過抑制細(xì)胞周期蛋白(cyclin)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)復(fù)合物的活性

3、，使大多數(shù)細(xì)胞停滯在G0/G1期，在心肌肥大過程中發(fā)揮重要的作用。雷公藤甲素又稱雷公藤內(nèi)酯醇(triptolide，TP)，具有調(diào)節(jié)CDKN1a表達(dá)的作用，但其對心肌肥大作用尚不明確。本課題旨在研究CDKN1a在心肌肥大中的調(diào)節(jié)機(jī)制，通過觀察雷公藤甲素對CDKN1a的調(diào)節(jié)作用，探討調(diào)節(jié)細(xì)胞周期防治心肌肥大的可行性。
　　方法:
　　1.傳代培養(yǎng)H9c2細(xì)胞，MTT法檢測H9c2對TP的耐受濃度。
　　2.血管緊張素Ⅱ(

4、angiotensinⅡ，AngⅡ)1μmol/L孵育24h誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞肥大反應(yīng)。分別給予0.3、1、3、10μg/L的TP。熒光標(biāo)記鬼筆環(huán)肽染色，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，測定細(xì)胞面積。分別采用Real-time PCR和Western blot法檢測H9c2細(xì)胞α-MHC、β-MHC、ANP、CDKN1a mRNA及蛋白表達(dá)變化情況。
　　3.動物分組及模型建立:雄性小鼠30只，隨機(jī)分為對照組、模型組、TP(10、30、10

5、0μg·kg-1·d-1)以及TP對照組(n=5)，分別給予生理鹽水、恒速異丙腎上腺素(isoprenaline，ISO)灌注(40 mg·kg-1·d-1，14d)、ISO灌注+TP(10、30、100μg·kg-1·d-1，ip，qd)、TP(30μg·kg-1·d-1，ip，qd)。另取小鼠20只，隨機(jī)分為對照組、模型組、CDKN1a抑制劑組、CDKN1a腺病毒組，對照組與模型組處理同前;CDKN1a抑制劑組給予ISO灌注+3 m

6、g/kg的柄曲霉素(ip，qd); CDKN1a腺病毒組股靜脈注射2×107TU的Ad-CDKN1a腺病毒。
　　4.實(shí)驗(yàn)過程中，密切觀察小鼠一般狀況及死亡情況。末次給藥后，稱量體重，稱重法測定小鼠心臟指數(shù)。分別采用HE和Masson染色觀察心肌組織病理變化與膠原沉積情況。麥胚凝集素染色心肌細(xì)胞膜觀察計(jì)算細(xì)胞平均面積。
　　5.分別采用Real-time PCR和Western blot法檢測心肌組織中α-MHC、β-MHC

7、、ANP、CDKN1a mRNA及蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.0.1～10μg/L的TP孵育24h，H9c2細(xì)胞的生長沒有明顯變化，30μg/L濃度的TP則明顯抑制細(xì)胞生長(p＜0.05)。而1.0～30.0μg/L TP作用48h明顯抑制細(xì)胞的生長(p＜0.01)。
　　2.模型組H9c2細(xì)胞面積明顯大于對照組，而在1、3、10μg/L三個劑量TP作用下，細(xì)胞面積顯著減小。模型組α-MHC mRNA和蛋白質(zhì)較

8、對照組明顯降低，β-MHC、ANP、CDKN1a的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)則明顯增高。1、3、10μg/L的TP能顯著升高α-MHC mRNA及其蛋白質(zhì)表達(dá)，減少β-MHC、ANP、CDKN1a的mRNA及其蛋白質(zhì)表達(dá)。
　　3.對照組小鼠皮毛順滑有光澤，精神狀態(tài)佳，進(jìn)食活動自如;模型組小鼠則呼吸急促，活動較少;TP給藥處理組、TP對照組、CDKN1a腺病毒組小鼠活動與進(jìn)食情況明顯優(yōu)于模型組。
　　4.ISO灌注模型組小鼠心肌損

9、傷明顯，心臟指數(shù)顯著升高，TP(30、100μg/kg)及柄曲霉素能明顯改善心肌組織損傷，降低心臟指數(shù)。
　　5.模型組動物心肌纖維斷裂明顯，纖維間隙與血管周圍膠原沉積，而TP(10、30、100μg/kg)和柄曲霉素組纖維化程度明顯減輕。
　　6.模型組心肌細(xì)胞平均面積明顯升高，而TP(10、30、100μg/kg)和柄曲霉素組心肌細(xì)胞面積明顯降低。
　　7.ISO灌注明顯下調(diào)小鼠心肌組織中α-MHC mRNA和蛋白

10、質(zhì)表達(dá)，上調(diào)β-MHC、ANP、CDKN1a mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)。與模型組相比，TP(30、100μg/kg)能明顯糾正上述α-MHC、β-MHC、ANP、CDKN1a mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的異常;而10μg/kg TP組α-MHC mRNA和ANP蛋白表達(dá)與模型組相比，差異不顯著(p＞0.05)。CDKN1 a抑制劑柄曲霉素處理組α-MHC mRNA及其蛋白表達(dá)較模型組明顯升高，而β-MHC、ANP、CDKN1a的mRNA和蛋白表達(dá)