shRNA靶向抑制NF-κB基因治療食蟹猴子宮內(nèi)膜異位癥的研究.pdf

1、背景:
　　子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EM)是育齡期婦女中十分常見(jiàn)的婦科疾病，發(fā)病率大約在10％-15％，因其能夠引起嚴(yán)重的臨床癥狀，如下腹痛、痛經(jīng)、性交痛、不孕等，對(duì)廣大婦女的心身健康造成極大的影響。當(dāng)今隨著大眾健康意識(shí)的提高，發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)。自從19世紀(jì)該病報(bào)導(dǎo)以來(lái)，雖然經(jīng)過(guò)對(duì)該病一個(gè)多世紀(jì)的研究，其發(fā)病機(jī)制仍不清楚?？v觀各大學(xué)說(shuō)，如子宮內(nèi)膜種植學(xué)說(shuō)、體腔上皮化生學(xué)說(shuō)、淋巴和靜脈播散學(xué)說(shuō)及近期報(bào)道的干

2、細(xì)胞學(xué)說(shuō)、血管形成學(xué)說(shuō)、在位內(nèi)膜決定論學(xué)說(shuō)、內(nèi)分泌及免疫學(xué)說(shuō)等，均只能部分揭示該疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，仍無(wú)法系統(tǒng)的揭示其全面的發(fā)病機(jī)制，所以對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥的治療目前仍無(wú)較好的方案。然而，無(wú)論何種學(xué)說(shuō)，異位子宮內(nèi)膜的生長(zhǎng)必須經(jīng)過(guò)黏附、侵襲及血管生成這3個(gè)環(huán)節(jié)，因此，如能阻斷其中的某一過(guò)程，就能抑制子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展。
　　子宮內(nèi)膜異位癥雖然為良性疾病，但其具有類似腫瘤的特性，如子宮內(nèi)膜異病灶可在盆腹腔內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移，形成相應(yīng)的病變

3、。目前，針對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥的治療主要集中在激素類藥物及手術(shù)治療，但治療效果均不理想，復(fù)發(fā)率較高，因此，尋找新的治療方法顯得尤為重要，目前，基因治療已逐漸成為一種新的治療策略。研究顯示，核因子кB(NF-кB)作為一種核轉(zhuǎn)錄因子，最早發(fā)現(xiàn)于B淋巴細(xì)胞內(nèi)，因其可與免疫球蛋白輕鏈基因增強(qiáng)子кB結(jié)合而被命名為NF-кB，其家族中有五個(gè)成員(RelA(p65)、RelB、c.Rel、NF-кB1（p50和它的前體p105）和NF-к B2（p52

4、和它的前體p100）），該因子廣泛存在于各種組織細(xì)胞中，正常情況下該因子以同源或者異源二聚體的形式與抑制蛋白IкB結(jié)合而存在于胞漿中，受激活因子刺激激活后，與IкB分離進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控目的基因的合成。目前發(fā)現(xiàn)，該因子在調(diào)控細(xì)胞增殖、血管形成、炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等生理病理過(guò)程中起著非常重要的作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，該因子與乳腺癌、前列腺癌、肺癌、直腸癌、宮頸癌等疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后過(guò)程均存在一定的相關(guān)性;同時(shí)，也有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)NF-кB也參與子宮

5、內(nèi)膜異位癥的病理生理過(guò)程。本課題組通過(guò)前期在裸鼠體內(nèi)的試驗(yàn)也證實(shí)，NF-кB在裸鼠子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，抑制NF-кB基因表達(dá)后，異位病灶明顯萎縮，微血管密度明顯減小。但裸鼠畢竟是低等動(dòng)物，很多生理功能與人類差距很大，因此，本研究采用與人類最接近的大型靈長(zhǎng)類動(dòng)物作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)RNA干擾技術(shù)，短發(fā)夾狀RNA（shRNA）靶向抑制NF-кB基因的表達(dá)，觀察其對(duì)靈長(zhǎng)類動(dòng)物子宮內(nèi)膜異位癥異位病灶發(fā)生發(fā)展的影響，初步評(píng)估其對(duì)

6、食蟹猴子宮內(nèi)膜異位癥的體內(nèi)治療效果及其安全性。
　　目的:
　　1.通過(guò)體外手術(shù)方法構(gòu)建食蟹猴子宮內(nèi)膜異位癥模型，并觀察該建模手術(shù)的效果，為構(gòu)建大型靈長(zhǎng)類動(dòng)物子宮內(nèi)膜異位癥模型增加更多的選擇。
　　2.體外培養(yǎng)食蟹猴在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞，同時(shí)合成高特異性靶向NF-кB基因的shRNA腺病毒載體，利用該病毒載體干預(yù)原代培養(yǎng)的食蟹猴子宮內(nèi)膜細(xì)胞，通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組之間的凋亡細(xì)胞數(shù)目及凋亡蛋白的表達(dá)情況，評(píng)估其對(duì)體外培養(yǎng)的食

7、蟹猴子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖活動(dòng)是否具有直接的抑制效應(yīng)。
　　3.成功構(gòu)建食蟹猴子宮內(nèi)膜異位癥模型后，利用前期合成的NF-кB-shRNA腺病毒載體，對(duì)內(nèi)異病灶進(jìn)行直接注射，通過(guò)靶向抑制子宮內(nèi)膜異位癥NF-кB基因的表達(dá)后，觀察在干預(yù)后各組內(nèi)異位病灶在微血管密度、細(xì)胞核增殖抗原(PCNA)及NF-кB表達(dá)等的改變，評(píng)估其在治療食蟹猴子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生發(fā)展中的作用，并觀察其遠(yuǎn)期毒副作用。
　　方法:
　　1.選擇15只健康、體

8、重相近、月經(jīng)周期規(guī)律的雌性食蟹猴，分成實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組12只，對(duì)照組3只，術(shù)前進(jìn)行六個(gè)月經(jīng)周期的觀察，排除不健康食蟹猴。
　　2.在月經(jīng)周期的第8-15天，雌激素高峰的第3-5天，實(shí)驗(yàn)組行手術(shù)獲取子宮內(nèi)膜組織，分別種植到自體盆腔大網(wǎng)膜、子宮直腸窩、子宮表面等處;對(duì)照組以大網(wǎng)膜組織代替子宮內(nèi)膜組織種植到相同的位置。
　　3.分別于手術(shù)后第8周及第16周月經(jīng)周期的第8-15天行腹腔鏡探查，取可疑病灶行組織病理學(xué)檢查，觀察內(nèi)

9、異病灶鏡下有無(wú)子宮內(nèi)膜樣腺體結(jié)構(gòu)及間質(zhì)細(xì)胞。
　　4.設(shè)計(jì)攜帶有NF-кB-p65基因的shRNA腺病毒載體及相應(yīng)空載shRNA腺病毒載體，并進(jìn)行體外合成。
　　5.手術(shù)獲取新鮮食蟹猴子宮內(nèi)膜組織，體外進(jìn)行食蟹猴子宮內(nèi)膜細(xì)胞原代培養(yǎng)，分成實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染攜帶NF-кB-p65 shRNA的腺病毒，對(duì)照組轉(zhuǎn)染攜帶空載shRNA腺病毒載體，然后進(jìn)行共培養(yǎng)。比較兩組之間凋亡蛋白的表達(dá)及細(xì)胞周期的變化情況。
　　6.

10、準(zhǔn)備好構(gòu)建成功的食蟹猴子宮內(nèi)膜異位癥動(dòng)物模型及高特異性的靶向NF-кB基因的shRNA腺病毒及其陰性對(duì)照空載shRNA腺病毒。
　　7.將建模成功的食蟹猴分成實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組及單純建模組，將NF-кBshRNA腺病毒在腹腔鏡下直接注入實(shí)驗(yàn)組食蟹猴子宮內(nèi)膜異位病灶內(nèi)，陰性對(duì)照組在病灶內(nèi)注射空載shRNA腺病毒，單純建模組病灶內(nèi)注射生理鹽水。
　　8.注射腺病毒后4周，腹腔鏡下觀察病灶變化，取各組子宮內(nèi)膜異位病灶進(jìn)行CD34免

11、疫組化染色檢測(cè)微血管密度，并采用蛋白印跡法(western blot)檢測(cè)NF-кB及增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)蛋白的表達(dá)，6個(gè)月后處死各組食蟹猴，觀察各重要臟器的遠(yuǎn)期副作用。
　　9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±SD)描述，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)均為α=0.05。
　　結(jié)果:
　　1.術(shù)前對(duì)食蟹猴精神狀態(tài)、食欲、睡眠情況和月經(jīng)周

12、期的觀察:通過(guò)近六個(gè)月經(jīng)周期的觀察，發(fā)現(xiàn)所有食蟹猴精神均良好，無(wú)嗜睡、困怠的現(xiàn)象，觀察期間，食蟹猴睡眠、食欲均良好。所有食蟹猴均有規(guī)律的月經(jīng)周期，時(shí)間大概28-30天左右，行經(jīng)4-5天，與正常婦女月經(jīng)周期類似。
　　2.術(shù)后第8周探查顯示，15只實(shí)驗(yàn)猴中，5只盆腔內(nèi)膜種植處肉眼可見(jiàn)疑似異位內(nèi)膜病灶改變，5只形成異位囊腫，另外2只種植處肉眼未見(jiàn)異位病灶存在，可疑病灶行組織病理檢查可見(jiàn)完整腺體和間質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)。3只對(duì)照組食蟹猴未見(jiàn)可疑病

13、灶，取組織活檢未見(jiàn)整腺體和間質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)。術(shù)后第16周，再次行腹腔鏡探查，肉眼仍可見(jiàn)子宮內(nèi)膜異位病灶，并且存在不同程度的盆腔粘連，異位內(nèi)膜生長(zhǎng)情況與術(shù)后第8周基本相似。
　　3.成功合成了高特異性的腺病毒載體，對(duì)腺病毒載體進(jìn)行PCR和測(cè)序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，經(jīng)包裝產(chǎn)生的病毒滴度為1.58×1011U/ml。
　　4.NF-кB-p65 shRNA腺病毒感染食蟹猴子宮內(nèi)膜細(xì)胞后，實(shí)驗(yàn)組子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組

14、，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組進(jìn)入細(xì)胞分裂期細(xì)胞數(shù)明顯少于對(duì)照組。
　　5.實(shí)驗(yàn)組食蟹猴異位病灶較前萎縮，其微血管密度(0.00198±0.0003)較陰性對(duì)照組(0.02189±0.0026)、單純建模組(0.02451±0.0033)明顯減小，分別比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)組食蟹猴NF-кB蛋白的表達(dá)水平(0.338±0.174)較陰性對(duì)照組(0.678±0.021)、單純建模組(0.645±0

15、.098)明顯下降，分別比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)組食蟹猴PCNA蛋白的表達(dá)水平(0.37±0.17)低于陰性對(duì)照組(0.57±0.26)、單純建模組(0.57±0.28)，分別比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.此次研究根據(jù)種植學(xué)說(shuō)原理在國(guó)內(nèi)首次成功構(gòu)建了食蟹猴子宮內(nèi)膜異位癥動(dòng)物模型，為以后子宮內(nèi)膜異位癥在食蟹猴的研究提供了理論基礎(chǔ)，為子宮內(nèi)膜異位癥在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型的研究領(lǐng)域

16、增加了新的動(dòng)物選擇，并不是所有食蟹猴能成功構(gòu)建子宮內(nèi)膜異位癥模型提示個(gè)體遺傳、免疫等其他因素亦可能影響子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生。
　　2.攜帶NF-кB基因的腺病毒體外感染食蟹猴子宮內(nèi)膜細(xì)胞后可加速子宮內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡，并抑制子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖，為后期該基因在食蟹猴子宮內(nèi)膜異位癥模型上的研究提供理論基礎(chǔ)。
　　3.NF-кB shRNA通過(guò)靶向抑制NF-кB基因的表達(dá)后，能夠抑制食蟹猴子宮內(nèi)膜異位癥的進(jìn)展，抑制子宮內(nèi)膜異位病灶的血