周細(xì)胞在蛛網(wǎng)膜下腔出血后微血管痙攣及微循環(huán)障礙中作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是通常由顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂引起的臨床常見腦血管意外。由于其發(fā)病青睞青壯年人群，加之引起的致死致殘率居高不下、臨床治療效果欠佳，給社會(huì)經(jīng)濟(jì)和家庭生活帶來(lái)了極為沉重的負(fù)擔(dān)。近十年來(lái)的研究表明，蛛網(wǎng)膜下腔出血高死殘率的主要?dú)w因于SAH后繼發(fā)的早期腦損傷(Early braininjury, EBI)。故而，針對(duì)SAH后EBI病理致?lián)p機(jī)制展開研究，預(yù)

2、期篩選新的有效的治療靶標(biāo)，以期提高臨床患者的神經(jīng)功能預(yù)后，具有極為現(xiàn)實(shí)的社會(huì)意義。
　　早期腦損傷是蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期（72小時(shí)內(nèi)）發(fā)生的一系列復(fù)雜的病理生理機(jī)制，包括顱內(nèi)壓(Intracranial pressure，ICP)升高、灌注壓(Cerebral perfusion pressure，CPP)下降、腦血流(Cerebral blood flow，CBF)下降、腦積水、離子穩(wěn)態(tài)失衡、細(xì)胞死亡、血腦屏障破壞、腦水腫等，最

3、終導(dǎo)致腦微循環(huán)灌注不足，引起微循環(huán)障礙。微循環(huán)障礙導(dǎo)致的腦缺血缺氧損傷是蛛網(wǎng)膜下腔出血后最嚴(yán)重的并發(fā)癥。微血栓形成、微血管痙攣、腦血流自調(diào)節(jié)下降等促成微循環(huán)障礙，其中，微血管痙攣表現(xiàn)為管壁增厚、管腔狹窄、紅細(xì)胞流動(dòng)受阻，直接阻礙腦組織血供，導(dǎo)致腦缺血缺氧損傷。因此，緩解蛛網(wǎng)膜下腔出血后微血管痙攣是減輕微循環(huán)障礙，降低早期腦損傷，降低死殘率的一條有效途徑。
　　周細(xì)胞是一類多能性細(xì)胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，其主要定植于微血管基膜周邊，通

4、過(guò)對(duì)微循環(huán)血管進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而參與完整血腦屏障的維持或參與生理病理?xiàng)l件下腦組織微血管的再生作用。近年來(lái)，周細(xì)胞在病理?xiàng)l件下調(diào)控微循環(huán)的作用得到重視。研究表明，周細(xì)胞在缺氧或者電刺激下誘發(fā)微血管收縮，阻斷紅細(xì)胞流動(dòng)，導(dǎo)致微循環(huán)障礙。周細(xì)胞在高血壓、腦缺血、心肌梗塞等疾病的微循環(huán)調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用，這可能與周細(xì)胞表達(dá)一些肌動(dòng)蛋白（如α-SMA）具有收縮功能有關(guān)，但是周細(xì)胞在蛛網(wǎng)膜下腔出血中的作用仍然缺乏研究。此外，在SAH后腦血管痙攣及微循

5、環(huán)調(diào)節(jié)過(guò)程中，內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)在眾多調(diào)控因子中發(fā)揮重要的作用。eNOS源性的一氧化氮(NO)信號(hào)系統(tǒng)是調(diào)節(jié)腦血流動(dòng)力學(xué)的重要機(jī)制。已有研究表明，一氧化氮含量可激活周細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，且能被蛛網(wǎng)膜下腔出血后釋放的血紅蛋白清除，提示周細(xì)胞可能通過(guò)響應(yīng)一氧化氮信號(hào)，發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，調(diào)節(jié)血管功能。因此我們推測(cè)，蛛網(wǎng)膜下腔出血后一氧化氮信號(hào)被抑制，激活周細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換，周細(xì)胞介導(dǎo)微血管痙攣，進(jìn)而導(dǎo)致微循環(huán)障礙，最終引起蛛網(wǎng)膜下腔出血

6、后早期腦損傷。
　　為了驗(yàn)證上述假說(shuō)，本研究分二部分進(jìn)行。第一部分采用頸內(nèi)動(dòng)脈線栓刺破法建立大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型，分別給予eNOS抑制劑L-NNA以及其激動(dòng)劑scutellarin，活體觀察微血管痙攣，免疫熒光檢測(cè)周細(xì)胞表達(dá)，在體觀測(cè)干預(yù)后對(duì)大鼠死亡率、體重、神經(jīng)功能缺損、腦組織含水量、血腦屏障通透性損害的影響，并通過(guò)HE及免疫組化染色檢測(cè)蛛網(wǎng)膜下腔出血后血紅蛋白的分布。通過(guò)第一部分的在體實(shí)驗(yàn)明確周細(xì)胞是否介導(dǎo)了蛛網(wǎng)膜下腔出血后

7、微血管痙攣，進(jìn)而惡化了微循環(huán)，明確scutellarin干預(yù)eNOS源性的NO后是否緩解微血管痙攣，減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷。第二部分通過(guò)建立大鼠腦周細(xì)胞培養(yǎng)體系和腦片微循環(huán)研究模型，用血紅蛋白處理腦片和細(xì)胞，再用一氧化氮清除劑PTIO以及其緩釋劑DETA/NO進(jìn)行干預(yù)，腦片模型觀測(cè)干預(yù)后微血管在周細(xì)胞處收縮的情況;在各時(shí)相點(diǎn)，采用RT-PCR檢測(cè)周細(xì)胞α-SMA核酸轉(zhuǎn)錄水平、WB檢測(cè)其蛋白表達(dá)變化。通過(guò)第二部分的離體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明

8、確血紅蛋白誘導(dǎo)的一氧化氮信號(hào)抑制在周細(xì)胞表性轉(zhuǎn)換以及微血管痙攣中的作用。
　　方法:
　　第一部分（在體）:
　　采用血管內(nèi)穿刺法，建立了SD大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型;將動(dòng)物隨機(jī)分為4組:假手術(shù)組(Sham)、蛛網(wǎng)膜下腔出血組(SAH+Vehicle)、L-NNA干預(yù)組(SAH+L-NNA)以及scutellarin干預(yù)組(SAH+scutellarin)。
　　1、活體熒光成像檢測(cè)大鼠腦表層微血管痙攣及微循環(huán)障礙

9、情況;
　　2、分別測(cè)定大鼠體重變化、死亡率、出血量、腦組織含水量、神經(jīng)功能缺損、血腦屏障通透性變化;
　　3、生化檢測(cè)腦組織eNOS活性及NO含量，WB檢測(cè)一氧化氮合酶各亞型蛋白表達(dá);
　　4、組織學(xué)檢測(cè):免疫熒光檢測(cè)SAH后周細(xì)胞PDGFRβ及α-SMA表達(dá);免疫組化及H&E染色檢測(cè)SAH后血紅蛋白的分布;
　　第二部分（離體）:
　　為了直接觀測(cè)血紅蛋白對(duì)微血管痙攣的作用，建立大鼠腦片模型，并分別用人

10、工腦脊液、血紅蛋白、PTIO、L-NNA以及DETA/NO灌流腦片;為了觀察血紅蛋白和NO信號(hào)對(duì)周細(xì)胞α-SMA表達(dá)的影響，建立大鼠腦周細(xì)胞離體培養(yǎng)模型，并將細(xì)胞分為4組:空白對(duì)照組(control)、血紅蛋白處理組(Hb)、PTIO干預(yù)組(Hb+PTIO)、DETA/NO干預(yù)組（Hb+DETA/NO）。
　　1、用不同藥物處理腦片后，正置紅外顯微鏡下觀測(cè)微血管收縮，及局部微循環(huán)變化;
　　2、采用WB及RT-PCR檢測(cè)各組

11、周細(xì)胞α-SMA蛋白及mRNA表達(dá);
　　3、生化檢測(cè)各組培養(yǎng)液一氧化氮含量;
　　4、分別用Hb及PTIO孵育細(xì)胞0h、3h、6h、12h，采用WB及RT-PCR檢測(cè)各組周細(xì)胞α-SMA蛋白及mRNA表達(dá);
　　5、PTIO預(yù)處理細(xì)胞6小時(shí)后，再用不同濃度(0mM、0.1mM、1mM、10mM)DETA/NO及8-Br-cGMP孵育細(xì)胞3小時(shí)，WB檢測(cè)周細(xì)胞α-SMA表達(dá);
　　結(jié)果:
　　第一部分（在體

12、）:
　　1、蛛網(wǎng)膜下腔出血后3小時(shí)，觀察到腦皮層微血管痙攣，微循環(huán)障礙。給予scutellarin干預(yù)后微血管痙攣的數(shù)量及程度都得以緩解，給予L-NNA處理后，微血管痙攣加重;
　　2、蛛網(wǎng)膜下腔出血后各組體重、出血量變化無(wú)明顯差異;scutellarin可以減輕大鼠SAH后的神經(jīng)功能缺損，緩解腦水腫程度，降低血腦屏障通透性損害。L-NNA加重SAH大鼠神經(jīng)功能障礙，對(duì)腦組織水腫程度，血腦屏障通透性無(wú)顯著影響。
　　

13、3、蛛網(wǎng)膜下腔出血后eNOS蛋白的表達(dá)及活性下降，一氧化氮含量減少。scutellarin能特異性的上調(diào)eNOS表達(dá)，升高其活性，緩解SAH后一氧化氮的急劇下降。給予L-NNA處理后進(jìn)一步降低SAH大鼠腦組織eNOS表達(dá)及活性，加劇SAH后一氧化氮的下降;
　　4、大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后血紅蛋白釋放，在早期（6小時(shí)）就可侵入腦實(shí)質(zhì)。同時(shí)，周細(xì)胞PDGFRβ和α-SMA在蛛網(wǎng)膜下腔出血后表達(dá)也增強(qiáng);
　　第二部分（離體）:

14、>　　1、血紅蛋白誘導(dǎo)腦片微血管痙攣，收縮發(fā)生在周細(xì)胞樣細(xì)胞處。DETA/NO和腦脊液灌洗均能緩解血紅蛋白導(dǎo)致的微血管痙攣。單獨(dú)用PTIO和L-NNA灌流腦片也能在微血管周細(xì)胞樣細(xì)胞處誘發(fā)收縮。
　　2、血紅蛋白誘導(dǎo)周細(xì)胞α-SMA表達(dá)增強(qiáng)。一氧化氮緩釋劑DETA/NO干預(yù)可阻斷血紅蛋白的作用。給予一氧化氮清除劑PTIO后進(jìn)一步增強(qiáng)α-SMA表達(dá)。
　　3、血紅蛋白及PTIO均能使培養(yǎng)液中的一氧化氮含量顯著下降，DETA/N

15、O能逆轉(zhuǎn)血紅蛋白誘導(dǎo)的一氧化氮濃度降低。
　　4、血紅蛋白及PTIO使周細(xì)胞α-SMA蛋白及mRNA表達(dá)在12小時(shí)內(nèi)上調(diào)。
　　5、誘導(dǎo)PTIO清除培養(yǎng)液中的一氧化氮后，給予一氧化氮緩釋劑DETA/NO或者cGMP類似物8-Br-cGMP均能下調(diào)周細(xì)胞α-SMA表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期eNOS表達(dá)及活性降低，NO濃度下降，周細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換，微血管痙攣以及微循環(huán)障礙。
　　2.Scute