周細胞在蛛網(wǎng)膜下腔出血后微血管痙攣及微循環(huán)障礙中作用機制研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是通常由顱內(nèi)動脈瘤破裂引起的臨床常見腦血管意外。由于其發(fā)病青睞青壯年人群，加之引起的致死致殘率居高不下、臨床治療效果欠佳，給社會經(jīng)濟和家庭生活帶來了極為沉重的負擔。近十年來的研究表明，蛛網(wǎng)膜下腔出血高死殘率的主要歸因于SAH后繼發(fā)的早期腦損傷(Early braininjury, EBI)。故而，針對SAH后EBI病理致?lián)p機制展開研究，預(yù)

2、期篩選新的有效的治療靶標，以期提高臨床患者的神經(jīng)功能預(yù)后，具有極為現(xiàn)實的社會意義。
　　早期腦損傷是蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期（72小時內(nèi)）發(fā)生的一系列復(fù)雜的病理生理機制，包括顱內(nèi)壓(Intracranial pressure，ICP)升高、灌注壓(Cerebral perfusion pressure，CPP)下降、腦血流(Cerebral blood flow，CBF)下降、腦積水、離子穩(wěn)態(tài)失衡、細胞死亡、血腦屏障破壞、腦水腫等，最

3、終導(dǎo)致腦微循環(huán)灌注不足，引起微循環(huán)障礙。微循環(huán)障礙導(dǎo)致的腦缺血缺氧損傷是蛛網(wǎng)膜下腔出血后最嚴重的并發(fā)癥。微血栓形成、微血管痙攣、腦血流自調(diào)節(jié)下降等促成微循環(huán)障礙，其中，微血管痙攣表現(xiàn)為管壁增厚、管腔狹窄、紅細胞流動受阻，直接阻礙腦組織血供，導(dǎo)致腦缺血缺氧損傷。因此，緩解蛛網(wǎng)膜下腔出血后微血管痙攣是減輕微循環(huán)障礙，降低早期腦損傷，降低死殘率的一條有效途徑。
　　周細胞是一類多能性細胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，其主要定植于微血管基膜周邊，通

4、過對微循環(huán)血管進行調(diào)控，進而參與完整血腦屏障的維持或參與生理病理條件下腦組織微血管的再生作用。近年來，周細胞在病理條件下調(diào)控微循環(huán)的作用得到重視。研究表明，周細胞在缺氧或者電刺激下誘發(fā)微血管收縮，阻斷紅細胞流動，導(dǎo)致微循環(huán)障礙。周細胞在高血壓、腦缺血、心肌梗塞等疾病的微循環(huán)調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用，這可能與周細胞表達一些肌動蛋白（如α-SMA）具有收縮功能有關(guān)，但是周細胞在蛛網(wǎng)膜下腔出血中的作用仍然缺乏研究。此外，在SAH后腦血管痙攣及微循

5、環(huán)調(diào)節(jié)過程中，內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)在眾多調(diào)控因子中發(fā)揮重要的作用。eNOS源性的一氧化氮(NO)信號系統(tǒng)是調(diào)節(jié)腦血流動力學(xué)的重要機制。已有研究表明，一氧化氮含量可激活周細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，且能被蛛網(wǎng)膜下腔出血后釋放的血紅蛋白清除，提示周細胞可能通過響應(yīng)一氧化氮信號，發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，調(diào)節(jié)血管功能。因此我們推測，蛛網(wǎng)膜下腔出血后一氧化氮信號被抑制，激活周細胞的表型轉(zhuǎn)換，周細胞介導(dǎo)微血管痙攣，進而導(dǎo)致微循環(huán)障礙，最終引起蛛網(wǎng)膜下腔出血

6、后早期腦損傷。
　　為了驗證上述假說，本研究分二部分進行。第一部分采用頸內(nèi)動脈線栓刺破法建立大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型，分別給予eNOS抑制劑L-NNA以及其激動劑scutellarin，活體觀察微血管痙攣，免疫熒光檢測周細胞表達，在體觀測干預(yù)后對大鼠死亡率、體重、神經(jīng)功能缺損、腦組織含水量、血腦屏障通透性損害的影響，并通過HE及免疫組化染色檢測蛛網(wǎng)膜下腔出血后血紅蛋白的分布。通過第一部分的在體實驗明確周細胞是否介導(dǎo)了蛛網(wǎng)膜下腔出血后

7、微血管痙攣，進而惡化了微循環(huán)，明確scutellarin干預(yù)eNOS源性的NO后是否緩解微血管痙攣，減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷。第二部分通過建立大鼠腦周細胞培養(yǎng)體系和腦片微循環(huán)研究模型，用血紅蛋白處理腦片和細胞，再用一氧化氮清除劑PTIO以及其緩釋劑DETA/NO進行干預(yù)，腦片模型觀測干預(yù)后微血管在周細胞處收縮的情況;在各時相點，采用RT-PCR檢測周細胞α-SMA核酸轉(zhuǎn)錄水平、WB檢測其蛋白表達變化。通過第二部分的離體實驗進一步明

8、確血紅蛋白誘導(dǎo)的一氧化氮信號抑制在周細胞表性轉(zhuǎn)換以及微血管痙攣中的作用。
　　方法:
　　第一部分（在體）:
　　采用血管內(nèi)穿刺法，建立了SD大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型;將動物隨機分為4組:假手術(shù)組(Sham)、蛛網(wǎng)膜下腔出血組(SAH+Vehicle)、L-NNA干預(yù)組(SAH+L-NNA)以及scutellarin干預(yù)組(SAH+scutellarin)。
　　1、活體熒光成像檢測大鼠腦表層微血管痙攣及微循環(huán)障礙

9、情況;
　　2、分別測定大鼠體重變化、死亡率、出血量、腦組織含水量、神經(jīng)功能缺損、血腦屏障通透性變化;
　　3、生化檢測腦組織eNOS活性及NO含量，WB檢測一氧化氮合酶各亞型蛋白表達;
　　4、組織學(xué)檢測:免疫熒光檢測SAH后周細胞PDGFRβ及α-SMA表達;免疫組化及H&E染色檢測SAH后血紅蛋白的分布;
　　第二部分（離體）:
　　為了直接觀測血紅蛋白對微血管痙攣的作用，建立大鼠腦片模型，并分別用人

10、工腦脊液、血紅蛋白、PTIO、L-NNA以及DETA/NO灌流腦片;為了觀察血紅蛋白和NO信號對周細胞α-SMA表達的影響，建立大鼠腦周細胞離體培養(yǎng)模型，并將細胞分為4組:空白對照組(control)、血紅蛋白處理組(Hb)、PTIO干預(yù)組(Hb+PTIO)、DETA/NO干預(yù)組（Hb+DETA/NO）。
　　1、用不同藥物處理腦片后，正置紅外顯微鏡下觀測微血管收縮，及局部微循環(huán)變化;
　　2、采用WB及RT-PCR檢測各組

11、周細胞α-SMA蛋白及mRNA表達;
　　3、生化檢測各組培養(yǎng)液一氧化氮含量;
　　4、分別用Hb及PTIO孵育細胞0h、3h、6h、12h，采用WB及RT-PCR檢測各組周細胞α-SMA蛋白及mRNA表達;
　　5、PTIO預(yù)處理細胞6小時后，再用不同濃度(0mM、0.1mM、1mM、10mM)DETA/NO及8-Br-cGMP孵育細胞3小時，WB檢測周細胞α-SMA表達;
　　結(jié)果:
　　第一部分（在體

12、）:
　　1、蛛網(wǎng)膜下腔出血后3小時，觀察到腦皮層微血管痙攣，微循環(huán)障礙。給予scutellarin干預(yù)后微血管痙攣的數(shù)量及程度都得以緩解，給予L-NNA處理后，微血管痙攣加重;
　　2、蛛網(wǎng)膜下腔出血后各組體重、出血量變化無明顯差異;scutellarin可以減輕大鼠SAH后的神經(jīng)功能缺損，緩解腦水腫程度，降低血腦屏障通透性損害。L-NNA加重SAH大鼠神經(jīng)功能障礙，對腦組織水腫程度，血腦屏障通透性無顯著影響。
　　

13、3、蛛網(wǎng)膜下腔出血后eNOS蛋白的表達及活性下降，一氧化氮含量減少。scutellarin能特異性的上調(diào)eNOS表達，升高其活性，緩解SAH后一氧化氮的急劇下降。給予L-NNA處理后進一步降低SAH大鼠腦組織eNOS表達及活性，加劇SAH后一氧化氮的下降;
　　4、大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后血紅蛋白釋放，在早期（6小時）就可侵入腦實質(zhì)。同時，周細胞PDGFRβ和α-SMA在蛛網(wǎng)膜下腔出血后表達也增強;
　　第二部分（離體）:

14、>　　1、血紅蛋白誘導(dǎo)腦片微血管痙攣，收縮發(fā)生在周細胞樣細胞處。DETA/NO和腦脊液灌洗均能緩解血紅蛋白導(dǎo)致的微血管痙攣。單獨用PTIO和L-NNA灌流腦片也能在微血管周細胞樣細胞處誘發(fā)收縮。
　　2、血紅蛋白誘導(dǎo)周細胞α-SMA表達增強。一氧化氮緩釋劑DETA/NO干預(yù)可阻斷血紅蛋白的作用。給予一氧化氮清除劑PTIO后進一步增強α-SMA表達。
　　3、血紅蛋白及PTIO均能使培養(yǎng)液中的一氧化氮含量顯著下降，DETA/N

15、O能逆轉(zhuǎn)血紅蛋白誘導(dǎo)的一氧化氮濃度降低。
　　4、血紅蛋白及PTIO使周細胞α-SMA蛋白及mRNA表達在12小時內(nèi)上調(diào)。
　　5、誘導(dǎo)PTIO清除培養(yǎng)液中的一氧化氮后，給予一氧化氮緩釋劑DETA/NO或者cGMP類似物8-Br-cGMP均能下調(diào)周細胞α-SMA表達。
　　結(jié)論:
　　1.蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期eNOS表達及活性降低，NO濃度下降，周細胞表型轉(zhuǎn)換，微血管痙攣以及微循環(huán)障礙。
　　2.Scute