叢毛單胞菌CNB-1菌株合成PHA的研究及產(chǎn)PHA新種的分類(lèi)鑒定.pdf

1、本論文分析了叢毛單胞菌(Comamonas sp．)CNB-1菌株在不同情況下合成聚羥基烷酸(PHA)的組分和含量，并對(duì)相關(guān)基因和酶進(jìn)行了研究。結(jié)果表明該菌株可以利用多種短鏈有機(jī)酸和醇為底物合成短鏈PHA。單體中都有3HB的存在，而以戊酸和1,4-丁二醇為底物時(shí)可以合成高含量的3HV和4HB，分別可達(dá)菌體干重的47.7％及56.2％。二步培養(yǎng)時(shí)合成的PHA含量明顯高于一步培養(yǎng)時(shí)。多種碳源混合時(shí)，對(duì)于PHA的合成顯示出一定的促進(jìn)或抑制作用

2、，值得注意的是，1，4-丁二醇及其它醇類(lèi)醇類(lèi)的存在能促進(jìn)PHA的合成，推測(cè)與醇類(lèi)氧化過(guò)程中產(chǎn)生了更多的還原力有關(guān)。 在CNB-1菌株中可以檢測(cè)到合成短鏈PHA的硫解酶途徑中的3個(gè)酶即β-酮硫解酶、乙酰乙酰CoA還原酶和聚合酶的活性，尤其是β-酮硫解酶的活性很高。利用合成酶保守區(qū)的簡(jiǎn)并引物對(duì)CNB-1基因組Cosmid文庫(kù)進(jìn)行篩選，并對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。從測(cè)序得到的約46kb的序列中，找到了編碼以上3個(gè)酶的基因，以phaCAB的形

3、式組成一個(gè)基因簇，phaC前帶有一個(gè)啟動(dòng)子。將以上3個(gè)基因一起連到pET載體在E．coli BL21(DE3)菌株中進(jìn)行表達(dá)后，可以使E．coli合成占菌體千重3％的PHB，同時(shí)可以檢測(cè)到相應(yīng)的酶活，但酶活較低。進(jìn)一步將這3個(gè)基因單獨(dú)連接到pET載體進(jìn)行優(yōu)化表達(dá)后，SDS-PAGE可以檢測(cè)到明顯的蛋白表達(dá)條帶，酶活明顯高于原始菌株，PhaC、PhaA和PhaB的酶活分別約為原始菌株的4.1倍、71倍和2882倍。 由于CNB-1

4、菌株具有很強(qiáng)的以l，4-丁二醇為底物合成4HB聚合物的能力，為了分析其合成途徑并找到相關(guān)基因，對(duì)參與1，4-丁二醇氧化的醇脫氫酶進(jìn)行了探索性研究。利用分光光度法和非變性凝膠電泳活性染色法的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)存在一個(gè)組成型表達(dá)的依賴(lài)于NAD<'+>的1,4-丁二醇脫氫酶。此后對(duì)該酶進(jìn)行了分離純化，并測(cè)定了N端10個(gè)氨基酸序列，根據(jù)該酶變性前后的大小及其輔因子類(lèi)型，結(jié)合N端氨基酸序列，確定該酶屬于依賴(lài)于NAD<'+>的長(zhǎng)鏈多聚體脫氫酶類(lèi)群。

5、 除了對(duì)CNB-1菌株進(jìn)行研究外，本論文同時(shí)進(jìn)行了從南海油田沉積物中分離能產(chǎn)生PHA的新種的工作。分離純化得到約50株菌，采用16S rRNA基因序列分析，表明有三個(gè)為新種。經(jīng)過(guò)蘇丹黑染色分析，表明其中HY34號(hào)能合成PHA。根據(jù)多相分類(lèi)鑒定，將HYl定名為Salegentibacter catena(鏈狀需鹽桿菌)，將HY9定名為Cyclobacterium lianum (李氏環(huán)桿菌屬)，將HY34定為Rhodobacteracea