甘肅省冬蟲(chóng)夏草遺傳多樣性分析和人工培養(yǎng)條件的研究.pdf

1、冬蟲(chóng)夏草是我國(guó)一種藥食兼用的傳統(tǒng)名貴中藥材,現(xiàn)代研究證實(shí)具有重要的藥用價(jià)值。甘肅省是我國(guó)冬蟲(chóng)夏草的主要產(chǎn)地之一。為調(diào)查甘肅省三個(gè)主要產(chǎn)區(qū)所產(chǎn)冬蟲(chóng)夏草種類的系統(tǒng)發(fā)育及遺傳分化,本研究開(kāi)展了以甘肅省幾個(gè)冬蟲(chóng)夏草主產(chǎn)區(qū)的蟲(chóng)草資源進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)分析和相關(guān)研究。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.本研究從來(lái)自甘肅三個(gè)主要產(chǎn)區(qū)采集的冬蟲(chóng)夏草上分離到18個(gè)菌株,篩選出最佳培養(yǎng)基,研究其對(duì)溫度的適應(yīng)性,低溫下生長(zhǎng)較慢,18℃為最適生長(zhǎng)溫度,25℃及其

2、以上不能生長(zhǎng),并首次通過(guò)在培養(yǎng)基中斜插蓋玻片的方法在光學(xué)顯微鏡下清晰觀察菌絲和分生孢子形態(tài)；通過(guò)特殊培養(yǎng)在三角瓶中長(zhǎng)出與野生冬蟲(chóng)夏草“草頭”相同的子實(shí)體。從形態(tài)學(xué)上判定分離的菌株為中國(guó)被毛孢。
　　 2.采用改進(jìn)的CTAB法對(duì)菌株基因組DNA進(jìn)行提取。經(jīng)紫外分光光度計(jì)、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析。方法是,在提取緩沖液中加入 PVP和β-巰基乙醇,同時(shí)采用 tris-平衡飽和酚／氯仿／異戊醇,氯仿／異戊醇相結(jié)合的抽提法,通過(guò)加入3mo

3、l／L NaAc,經(jīng)冰凍無(wú)水乙醇沉降和70％乙醇多次洗滌。結(jié)果顯示,經(jīng)改良后的 CTAB法提取的基因組DNA片段完整、純度高、質(zhì)量好滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。
　　 3.通過(guò)優(yōu)化ISSR反應(yīng)體系首次確定了冬蟲(chóng)夏草25μL ISSR-PCR反應(yīng)體系為10×PCRBuffer2.5μL;模板20ng；dNTP0.12 mmol／L；Mg2+1.5 mmol／L；ISSR引物0.9μmol／L；Taq DNA聚合酶0.5U。
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4、.采用簡(jiǎn)單序列例重復(fù)(ISSR)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性分析和18S rDNA序列分析法,對(duì)18個(gè)菌株進(jìn)行標(biāo)記和系統(tǒng)發(fā)育分析。在ISSR分析中顯示出不同地域的樣本間遺傳分化較大,遺傳多樣性較豐富；同一地域不同地點(diǎn)間樣本存在遺傳分化；同一地點(diǎn)樣本間存在較小遺傳分化；分離自同一株蟲(chóng)草上的菌株之間不存在遺傳分化。在18S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析中顯示出在同一地域不同地點(diǎn)樣本間和同一地點(diǎn)不同樣本間具有較小的遺傳分化；分離至同一株蟲(chóng)草上不同部位的菌株不存在遺

5、傳分化。
　　 5.通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增出18個(gè)菌株間18S部分序列,通過(guò)測(cè)序分析。結(jié)果顯示18SrDNA序列長(zhǎng)372bp。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),各分離物與中國(guó)被毛孢(Hirsutella sinensis)之間僅有1-2個(gè)堿基的差異,相似性高達(dá)99％,遺傳距離在0.01以下。說(shuō)明18個(gè)菌株與H.sinensis彼此間在基因水平上是高度一致的。為了進(jìn)一步比較分離菌株無(wú)性型與中國(guó)被毛孢之間的關(guān)系,以蛹蟲(chóng)草(Cordyceps militar

6、is)和球孢菌(Cordyceps bassiana)作外群,并與同源性相關(guān)的菌物構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(shù),結(jié)果顯示18個(gè)分離菌株的無(wú)性型為中國(guó)被毛孢。
　　 6.首次采用苯酚-硫酸法測(cè)定中國(guó)被毛孢菌絲體多糖含量,高碘酸鈉比色法測(cè)定甘露醇含量,反相高效液相色譜法測(cè)定腺苷和蟲(chóng)草素含量。結(jié)果表明,天然冬蟲(chóng)夏草中存在蟲(chóng)草素且在甘肅不同產(chǎn)區(qū)分離得到的蟲(chóng)草菌多糖含量在1.66％～2.36％之間,甘露醇含量在2.04％～5.72％之間,蟲(chóng)草素和腺苷的

7、含量分別在47.213～76.927μg／g、249.778～439.797μg／g；同一產(chǎn)區(qū)不同地方分離到的蟲(chóng)草菌多糖含量在1.79％～2.00％之間,甘露醇含量在1.62％～1.79％之間,蟲(chóng)草素和腺苷的含量分別在45.331～49.96μg／g、92.404～376.375μg／g。通過(guò)顯著性分析說(shuō)明不同產(chǎn)地菌株間的活性成分含量差異顯著；同一產(chǎn)區(qū)菌株間除腺苷外活性成分含量差異不顯著。從多糖含量和腺苷含量上可以看出從甘南冬蟲(chóng)夏草上分