樺褐孔菌菌株遺傳多樣性及人工培養(yǎng)條件優(yōu)化模式研究.pdf

1、本文就樺褐孔菌菌株遺傳多樣性及人工培養(yǎng)條件優(yōu)化模式進(jìn)行了研究： 1.采用Tris-HCI(pH6.9)、TBE、Tris-甘氨酸(pH 8.3)、磷酸緩沖液(pH6.4)、Tris-HCl(pH 8.0)、Tris-HCl(pH 8.8)為提取劑，在同一條件下對(duì)樺褐孔菌菌絲體過(guò)氧化物酶同工酶進(jìn)行提取，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，對(duì)樺褐孔菌菌絲體的過(guò)氧化物酶同工酶譜帶進(jìn)行比較研究，結(jié)果表明采用Tris-HCI(pH 6.9)作為提

2、取劑圖譜條帶豐富，帶型清晰，提取效果最好。 2.采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，對(duì)樺褐孔菌野生菌核分離得到的8個(gè)菌株菌絲過(guò)氧化物酶同工酶進(jìn)行研究。結(jié)果表明，同一培養(yǎng)時(shí)期的各菌株間同工酶酶譜存在一定的差異，部分菌株間存在較近的親緣關(guān)系，所有菌株酶帶數(shù)目在2～8條之間，在Rf=0.75、Rf=0.98處所有菌株的酶帶都較寬且著色較深，此為樺褐孔菌菌株的特征酶帶。進(jìn)一步采用Fuzzy聚類法進(jìn)行數(shù)量分析表明，菌株間隸屬度在[0.250，1.

3、000]之間，當(dāng)隸屬度為0.250時(shí)將8個(gè)菌株分三類，菌株分類結(jié)果與各菌株的地理分布(緯度)差異一致。 3.采用CTAB改良法提取樺褐孔菌菌絲體基因組DNA，以其為模板對(duì)影響RAPD擴(kuò)增的重要參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化研究。結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增體系最佳反應(yīng)條件是：在25μl體積中，模板DNA濃度為40ng/μL，10堿基引物濃度為10pmol，Mg<'2+>濃度為2mmol/L，TaqDNA聚合酶1unit，dNTPs濃度為100μmol/L

4、。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，40℃退火1min，72℃延伸1.5min，45個(gè)循環(huán)；72℃后延伸5min。 4.采用RAPD標(biāo)記對(duì)8個(gè)樺褐孔菌菌株親緣關(guān)系進(jìn)行研究，獲得了樺褐孔菌不同菌株的DNA指紋圖譜。結(jié)果顯示：12個(gè)引物共擴(kuò)增出167條帶，其中101條為多態(tài)性帶，多態(tài)性比率為60.5％，表明RAPD標(biāo)記可以用來(lái)對(duì)樺褐孔菌菌株進(jìn)行鑒定；同一培養(yǎng)時(shí)期的各菌株間RAPD指紋圖譜存在一定差異，若以遺傳距離

5、0.508為結(jié)合線，可將供試菌株劃分為三大類，朝鮮菌株CX01、CX02(39<'0>02～40<'0>48)歸為一類，吉林省菌株JL01、JL02、JL03、JL04、JL05(41<'0>32～43<'0>35)歸為一類，黑龍江菌株HLJ01(50<'0>13)單獨(dú)聚為一類。菌株分類結(jié)果與各菌株的地理分布差異一致，可以進(jìn)一步確定各菌株間屬于種內(nèi)地理分布差異，部分菌株間存在較近的親緣關(guān)系。 5.采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究了不同的碳

6、源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和不同pH、光照、溫度及水分處理對(duì)樺褐孔菌菌絲純培養(yǎng)性狀的影響，以菌絲體干重為指標(biāo)，利用三元二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)得到了優(yōu)化培養(yǎng)基配方。結(jié)果表明，樺褐孔菌菌絲體純培養(yǎng)的最佳模式為：葡萄糖27.60g/L、黃豆粉15.60g/L、硫酸鈣2.80g/L、磷酸二氫鉀1.50g/L，VB<,1>10mg/L、瓊脂20g/L；pH值5～7、溫度25～30℃、完全黑暗、適宜的二氧化碳濃度，菌絲體干重達(dá)19.02g/L。 6.以

7、菌絲體干重為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出了適宜樺褐孔菌菌絲體液體培養(yǎng)的最佳碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽，利用三元二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)得到了優(yōu)化培養(yǎng)基配方，并研究了裝液量、培養(yǎng)溫度、pH值、搖床轉(zhuǎn)速等對(duì)樺褐孔菌菌絲體液體培養(yǎng)性狀的影響。結(jié)果表明，樺褐孔菌菌絲體液體培養(yǎng)最佳模式為：葡萄糖23.00g/L，蛋白胨1.508/L，硫酸鎂1.00g/L，磷酸二氫鉀1.508/L，VB<,1>10mg/L；250ml三角瓶中裝液量140ml，培養(yǎng)溫度為25

8、℃，培養(yǎng)初始pH值為7.0，搖床轉(zhuǎn)速170r/min，接種量以一塊為宜，振蕩培養(yǎng)周期10～12d，菌絲體干重為1.156g/L。 7.以樺褐孔菌野生菌核為材料，采用組織分離方法獲得純菌種，并進(jìn)行了樺褐孔菌各級(jí)菌種的制作研究。結(jié)果表明：樺褐孔菌母種培養(yǎng)基以葡萄糖20g、黃豆粉10g、KH<,2>PO<,4>1g、MgSO<,4>0.5g、水1000ml，pH自然為最佳，菌絲生長(zhǎng)速度快、長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、顏色正；樺褐孔菌原種培養(yǎng)基以玉米粒或樺

9、木屑(粗)78％、麥麩20％、石膏1％、白糖1％、水分65％為最好；樺褐孔菌栽培種培養(yǎng)基以配方簡(jiǎn)單的木屑78％、麥麩20％、石膏1％、白糖1％、水分65％為最好；樺褐孔菌菌核人工代料栽培以樺木屑(細(xì))52％、玉米芯26％、麥麩20％、白糖1％、石膏1％、水分65％為最好，生物學(xué)效率達(dá)30.8％；樺褐孔菌菌核發(fā)生適宜溫度范圍在22～28℃、栽培袋不開(kāi)口、無(wú)光有利于菌核的形成。建議樺褐孔菌菌核人工栽培以代料栽培取代木段栽培。 8.對(duì)

10、樺褐孔菌人工培養(yǎng)菌絲體、菌核與野生菌核常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分、活性成分進(jìn)行了分析與比較。結(jié)果表明：樺褐孔菌人工培養(yǎng)菌絲體的一般營(yíng)養(yǎng)成分明顯高于人工培養(yǎng)菌核和野生菌核，特別是粗蛋白、粗多糖、灰分含量較高；樺褐孔菌人工培養(yǎng)菌絲體、菌核的礦質(zhì)元素含量均明顯高于野生菌核；樺褐孔菌人工培養(yǎng)菌絲體多糖含量明顯高于人工培養(yǎng)菌核、而人工培養(yǎng)菌核的多糖含量又明顯高于野生菌核。 9.采用HPLC指紋圖譜方法分析比較了樺褐孔菌人工培養(yǎng)菌絲體、菌核、野生菌核活性

11、成分三萜類物質(zhì)含量。結(jié)果表明：在相同的保留時(shí)間內(nèi)，三個(gè)圖譜的峰型與峰面積相似，可以判定它們均含有結(jié)構(gòu)比較相似的羊毛甾烯三萜類物質(zhì)；通過(guò)峰面積的分析比較可知，樺褐孔菌人工培養(yǎng)菌絲體中三萜類成分含量最高、其次為人工培養(yǎng)菌核，二者均高于野生菌核。 10.采用四氧嘧啶(200mg/kg體重)腹腔注射復(fù)制小鼠高血糖模型，分別給予小鼠樺褐孔菌人工培養(yǎng)菌絲體、菌核與野生菌核多糖提取物按不同劑量灌胃，葡萄糖氧化酶法測(cè)定各組的血糖水平，探討樺褐孔