樺褐孔菌多糖降糖成分篩選及結(jié)構(gòu)鑒定.pdf

1、目的:以樺褐孔菌為原料，提取樺褐孔菌多糖（IOP），分離純化得到樺褐孔菌均一多糖。篩選降糖活性較高的成分，測定其分子量和單糖組成，然后對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，并考察其抗氧化、抑菌及免疫調(diào)節(jié)的生物活性。
　　方法:（1）采用水提醇沉法，提取IOP，以IOP的提取率為考察指標(biāo)，優(yōu)化IOP的提取工藝；利用苯酚-硫酸法和考馬斯亮藍(lán)法分別測定樺褐孔菌粗多糖中的多糖含量和蛋白質(zhì)含量。（2）利用柱色譜的方法對提取得到的樺褐孔菌粗多糖進(jìn)行分離純化，樺褐

2、孔菌粗多糖經(jīng)大孔吸附樹脂柱純化后，采用DEAE-纖維素柱進(jìn)行分離。（3）采用高效凝膠滲透色譜-蒸發(fā)光檢測法測定各部分多糖的純度和分子量，采用PMP柱前衍生法測定IOP的單糖組成。（4）采用HepG2細(xì)胞作為體外受體模型，研究不同濃度的5種樺褐孔菌均一多糖對HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗的影響，篩選降糖活性較高的成分。（5）應(yīng)用高效液相色譜、高碘酸氧化和 Smith降解、甲基化分析以及紅外光譜等化學(xué)和儀器分析方法，對IOP的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。（6）

3、采用化學(xué)分析方法測定樺褐孔菌均一多糖對超氧陰離子自由基、羥基自由基和DPPH自由基的清除能力，檢測其體外抗氧化活性。（7）采用藥敏紙片法測定IOP對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌和綠膿桿菌的抑菌作用，并采用倍比稀釋法，測定其最低抑菌濃度和最低殺菌濃度。（8）通過檢測IOP對小鼠脾細(xì)胞體外增殖影響，探討IOP對免疫功能調(diào)節(jié)的作用。
　　結(jié)果:（1）在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面優(yōu)化得到IOP提取的最佳工藝參數(shù)為：料液比1:22

4、，提取時(shí)間2.5 h，提取溫度90℃。IOP的提取率達(dá)到13.43％。粗多糖中多糖含量為19.43%，蛋白質(zhì)含量為9.70%。（2）樺褐孔菌粗多糖經(jīng)大孔吸附樹脂柱純化后，采用 DEAE-纖維素柱進(jìn)行分離得到5個(gè)均一多糖 IOP1、IOP2、IOP3、IOP4和IOP5。（3）5個(gè)樺褐孔菌均一多糖的分子量分別為3.39×105 Da、7.90×105 Da、4.26×105 Da、1.82×106 Da和9.66×105 Da。IOP1是

5、由Man、Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal、Xyl和Ara組成，其摩爾比為5.37:3.61:1.00:1.13:8.78:14.83:3.41:1.91；IOP2是由Man、Rha、GlcA、Glc、Gal、Xyl和Ara組成，其摩爾比為3.63:1.00:1.79:1.90:6.38:3.26:3.79；IOP3是由Man、Rha、GalA、Gal、Xyl和Ara組成，其摩爾比為4.47:1.71:2.98:2.31:1.

6、24:1.00；IOP4是由Man、Rha、GlcA、GalA、Glc和Xyl組成，其摩爾比為6.41:3.45:1.00:1.20:10.21:11.51；IOP5是由Man、Rha、GalA、Gal、Xyl和Ara組成，其摩爾比為3.70:1.00:1.44:1.48:1.23:1.62。（4）不同濃度的IOP1、IOP2、IOP3、IOP4和IOP5均能促進(jìn)HepG2細(xì)胞對培養(yǎng)液中葡萄糖的攝取，其中以IOP1的作用效果最好。當(dāng)IO

7、P1濃度為0.25 mg·mL-1時(shí)，作用效果最好。IOP1、IOP2、IOP3、IOP4和IOP5在0.25 mg·mL-1時(shí)均能促進(jìn)胰島素抵抗細(xì)胞模型的葡萄糖消耗，且隨著時(shí)間的延長細(xì)胞的葡萄糖消耗逐漸增加，且以IOP1的作用最顯著。（5）通過高碘酸氧化、Smith降解、甲基化分析、紅外光譜等方法研究樺褐孔菌均一多糖結(jié)構(gòu)，得到了IOP1糖殘基的各種連接方式，且IOP1主鏈主要由Glc和Gal構(gòu)成。（6）IOP具有顯著的清除自由基能力，

8、并呈一定的量效關(guān)系。在IOP濃度較高的條件下，對羥基自由基及DPPH的清除能力較為顯著，對超氧陰離子的清除能力次之。（7）不同濃度的IOP的抑菌效果為金黃色葡萄球菌>枯草桿菌>大腸桿菌>綠膿桿菌。對金黃色葡萄球菌的最低殺菌濃度為12.5 mg·mL-1，對大腸桿菌、枯草桿菌和綠膿桿菌的最低殺菌濃度為25 mg·mL-1。（8）IOP高中劑量組對ConA誘導(dǎo)的脾細(xì)胞增殖均有顯著的促進(jìn)作用，而低劑量組體外能抑制ConA誘導(dǎo)的脾細(xì)胞增殖作用；