農桿菌介導的轉基因技術研究WRKY轉錄因子的功能機T-DNA的串連重復.pdf

1、在植物基因工程的發(fā)展過程中，根癌農桿菌介導的遺傳轉化是研究最清楚和應用最廣泛的一種方法，因其費用低、拷貝數(shù)低、重復性好、基因沉默現(xiàn)象少、轉育周期短及能轉化較大片段等獨特優(yōu)點而備受科學工作者的青睞，因此，我們用這種技術研究了WRKY基因家族。目前有許多研究表明，WRKY轉錄因子家族參與了植物防御反應，然而，有關特定WRKY蛋白在植物防御系統(tǒng)中作用的研究報道仍然是很少的。
　　本文從煙草中克隆了一個對煙草花葉病毒（Tobacco mo

2、saic virus，TMV）具有應答的WRKY基因，它與其他植物中的WRKY40同源性較高，因此命名為NtWRKY40。為了解NtWRKY40基因的功能，本研究通過構建35S:NtWRKY40過表達載體和RNAi-NtWRKY40抑制表達載體，利用農桿菌介導的葉盤法獲得轉基因植株。分別在病毒侵染后的三個階段（6h、3d、9d）取非侵染葉，利用實時熒光定量PCR技術，檢測NtWRKY40基因以及病毒外殼蛋白基因（Coat Protein

3、,CP）和移動蛋白基因（Move Protein,MP）的表達水平，結果表明：野生植株在侵染后6h和3d這兩個階段，NtWRKY40的表達僅升高了一兩倍，但侵染后9d，NtWRKY40的表達量顯著升高，達到一百五十多倍；而35S:NtWRKY40過表達轉基因植株在病毒侵染后的三個時間段中，NtWRKY40的表達均沒有顯著變化。
　　為了研究病毒侵染后35S:NtWRKY40過表達轉基因植株和野生植株中病毒的表達特點，分析NtWRK

4、Y40基因與感病程度的關系，我們分別以轉基因植株和野生植株病毒侵染后6h的病毒表達量為參照，分析侵染后3d和9d野生植株和轉基因植株中病毒基因CP和MP的表達變化，從我們的數(shù)據(jù)以及植物的感病情況可以得出，35S:NtWRKY40過表達植株對TMV的敏感性較野生型植株更強。由于目前所獲得的RNAi-NtWRKY40轉基因植株較少，還未進行病毒侵染實驗。通過上述結果可以推測NtWRKY40在煙草逆境應答響應中具有重要的作用，為進一步研究該基

5、因的功能提供基礎。
　　在農桿菌的轉化過程中經(jīng)常出現(xiàn)多個T-DNA插入同一個位點和多插入位點的頻繁出現(xiàn)，這些T-DNA串聯(lián)重復結構經(jīng)常會導致目標基因的共抑制，甚至是基因沉默，從而影響后續(xù)的實驗，因此我們使用了一種高效準確的實時熒光定量PCR方法，篩選和定量大量的轉基因植物株系中T-DNA的拷貝數(shù)和分析T-DNA串聯(lián)結構。此外，我們還結合了多倍儀PCR方法，快速的克隆和分析串聯(lián)結構間的填充DNA序列，序列分析表明，在直接串聯(lián)的T-D