PKC-NF-κB在大鼠晶狀體損傷后促進視神經(jīng)再生的研究.pdf

1、視神經(jīng)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，隨著哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的成熟，視神經(jīng)損傷后的再生修復將變得極其困難。臨床上大多數(shù)創(chuàng)傷性視神經(jīng)疾病、退行性視覺通路疾病或缺血性視神經(jīng)損傷的患者將承受不可逆的視力損害，更嚴重的會導致視力完全喪失，因此關于視神經(jīng)損傷后再生修復的研究對于患者視力的提高及生活自信心的增強有重要的實踐意義。視神經(jīng)的起始部是視網(wǎng)膜處的視盤，而視網(wǎng)膜的視盤處匯集了大量視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglioncells，R

2、GCs)的軸突。在高等動物中，視網(wǎng)膜視覺輸出的相關細胞只有RGCs，所以關于視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的探討對視網(wǎng)膜的再生修復來說是很有必要的。目前，關于視神經(jīng)損傷后修復再生的方向主要關注于如何在視神經(jīng)損傷后保留更多的RGCs、如何使保留的RGCs軸突延長、如何恢復視覺靶點之間的聯(lián)系和功能三個方面。
　　晶狀體損傷如何促進受損視神經(jīng)的再生是當今科研范疇的一大熱點和難點。國內外學者從調節(jié)各個細胞內信號通路、清除再生抑制因子、激活神

3、經(jīng)膠質細胞、單獨或聯(lián)合應用神經(jīng)營養(yǎng)因子等方面進行了一系列深入的探討，從不同方面都證明了大鼠視神經(jīng)損傷伴晶狀體損傷可以在一定水平上促進視神經(jīng)的再生。本課題組對神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜中Müller細胞、Nogo-AmRNA及Nogo-A的表達,巨噬細胞、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)、鋅指蛋白核轉錄因子4（Kruppel-like transcription factor4，KLF4）、白血病

4、抑制因子(1eukemia inhibitory factor,LIF)的實驗研究中，一方面從不同的角度運用了不同的方式探索了視神經(jīng)晶狀體聯(lián)合損傷促進受損視神經(jīng)的再生修復的機制，另一方面也為視神經(jīng)損傷后的治療策略的制定、治療藥物的選用、治療效果的評估提供了新的思路。本次通過對視神經(jīng)損傷伴晶狀體損傷PKC活性與NF-κBp65蛋白表達量的研究，對晶狀體損傷后促進視神經(jīng)再生的機制進行更深一步的探索。
　　目的：
　　通過對單純視

5、神經(jīng)鉗夾損傷及視神經(jīng)鉗夾損傷聯(lián)合晶狀體損傷大鼠視網(wǎng)膜中PKC活性與NF-κBp65蛋白表達量的研究，初步探討視神經(jīng)損傷伴晶狀體損傷促進視神經(jīng)再生修復的作用機制，證實晶狀體損傷可通過對PKC與NF-κBp65表達的調節(jié)來發(fā)揮保護視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的作用，為臨床治療視神經(jīng)損傷提供新的靶點和思路。
　　方法：
　　清潔健康Wistar成年大鼠60只,雌雄不分，按隨機數(shù)字表法分成四組：正常對照組6只(即A組)，假手術組18只（僅暴露而

6、不損傷視神經(jīng)組，即B組），視神經(jīng)鉗夾損傷組18只（即C組），視神經(jīng)鉗夾損傷聯(lián)合晶狀體損傷組18只(即D組)。A組于正常飼養(yǎng)7d后麻醉過量處死大鼠6只，B組、C組、D組于術后7d、14d、21d分別麻醉處死大鼠各6只。各組每個時間點取2只大鼠行熒光金逆行標記后RGCs進行觀察并計數(shù)，2只應用氚標記的二丁酸佛波醇脂（([3H]PDBu)）檢測各組大鼠不同時間點視網(wǎng)膜PKC的活性變化，2只行Western blot檢測視網(wǎng)膜NF-κBp65蛋

7、白的表達情況。
　　結果：
　　1.熒光金標記的大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞
　　在熒光顯微鏡下觀察A組及B組大鼠視網(wǎng)膜鋪片中熒光金標記的RGCs，可見被熒光金標記的RGCs的形態(tài)學特征具有特異性，呈金黃色，形狀大多數(shù)為圓形或橢圓形，邊界較清晰，大小不一，部分細胞突起清晰可見,A組及B組RGCs分布在各個時間點比較穩(wěn)定。而C、D組視網(wǎng)膜鋪片，隨著鉗夾損傷時間的增加，RGCs的分布逐漸稀疏，RGCs的形狀縮小變圓，熒光著色增強，

8、突起腫脹或消失。損傷后7d、14d、21d同一時間點C、D組與B組RGCs計數(shù)及標識率相比，差異均有統(tǒng)計學意義（均 P<0.05）；同一時間點，D組RGCs計數(shù)高于C組，且差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）；而A、B兩組RGCs計數(shù)相互比較，差異無統(tǒng)計學意義（均P>0.05）。
　　2.各組PKC活化水平之間相互比較
　　A組及B組PKC活化水平基本穩(wěn)定，C組及D組視網(wǎng)膜在傷后7d、14d、及21d均可見PKC的活性增加，

9、PKC的活性在視神經(jīng)鉗夾傷后7d后顯著增加，并在視神經(jīng)鉗夾傷后14d達到高點，在21d在仍維持較高水平。B組暴露視神經(jīng)后7d、14d、及21d的PKC活性與A組PKC的活性相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；C組及D組視神經(jīng)鉗夾傷后7d、14d、21d與B組同一時間點PKC的活性相比有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；同一時間點，D組神經(jīng)鉗夾傷后PKC的活性高于C組，且差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　3.各組NF-κBp65

10、蛋白表達量之間相互比較
　　A組、B組NF-κBp65蛋白表達量相互比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），C組及D組視網(wǎng)膜視神經(jīng)鉗夾傷后可見NF-κB p65蛋白表達量增加，在視神經(jīng)鉗夾傷后14d后達到高點后開始下降。在相同時間點C、D兩組相互比較，C組神經(jīng)鉗夾傷后的NF-κB p65蛋白表達量高于D組，且差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　結論：
　　1.隨著視神經(jīng)鉗夾損傷后時間的延長，RGCs計數(shù)不斷下降，