調(diào)節(jié)PKC-NF-κB-SOCS3信號(hào)通路促進(jìn)成年大鼠視神經(jīng)再生的研究.pdf

1、視神經(jīng)損傷是顱腦損傷一種常見的嚴(yán)重并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為持續(xù)性視覺功能障礙，可分為直接損傷和間接損傷。視神經(jīng)直接損傷，常見于顏面部穿通傷，尤其是眼眶骨折碎片直接刺傷視神經(jīng)。這種損傷直接導(dǎo)致視神經(jīng)撕裂，甚至完全離斷，損傷嚴(yán)重，目前尚無(wú)有效的治療方法。然而，視神經(jīng)間接損傷臨床相對(duì)更常見，閉合性顱腦損傷合并間接視神經(jīng)損傷發(fā)生率為0.5％～5％，即使采用視神經(jīng)管減壓術(shù)聯(lián)合激素沖擊治療，效果并不理想，結(jié)果常導(dǎo)致視覺功能不可逆性損害。這與視神經(jīng)病理生理

2、特征有關(guān)。視神經(jīng)由視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinalganglion cells，RGCs)的一段軸突所組成。RGCs位于視網(wǎng)膜最內(nèi)層—神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，是視網(wǎng)膜內(nèi)唯一向腦內(nèi)投射的一類神經(jīng)元。從胚胎發(fā)生學(xué)角度看，視網(wǎng)膜來(lái)源于神經(jīng)外胚層，屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）的一部分。因此，視神經(jīng)雖然名義上屬于周圍神經(jīng)系統(tǒng)(peripheral nervoussystem，PNS)，但其本質(zhì)上卻是CNS一部分，

3、屬于CNS白質(zhì)。盡管包括視神經(jīng)在內(nèi)的成年哺乳動(dòng)物CNS具有一定的再生能力已經(jīng)得到了證實(shí)，CNS再生的研究也已取得一定的進(jìn)展，但是CNS損傷后自發(fā)的再生能力有限，不足以恢復(fù)受損的神經(jīng)功能。研究表明CNS膠質(zhì)微環(huán)境是阻礙CNS再生的重要因素，因此，研究膠質(zhì)微環(huán)境抑制CNS再生的分子機(jī)制，對(duì)修復(fù)視神經(jīng)損傷或其它CNS損傷具有重要理論和臨床意義。
　　成年哺乳動(dòng)物中CNS髓鞘中Nogo、髓鞘相關(guān)糖蛋白(myelin-associatedg

4、lycoprotein，MAG)和少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白(oligodendrocyte myelinglycoprotein，Omgp)以及膠質(zhì)瘢痕中硫酸軟骨素蛋白多糖(chondroitin sulphateproteoglycans，CSPGs)是抑制CNS再生的重要分子。Nogo、MAG和Omgp有一個(gè)共同受體，即Nogo受體(Nogo receptor，NgR)。NgR是一種糖基磷脂酰肌醇錨鏈蛋白，缺乏細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，不能直接將

5、細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)。因此，NgR必須與其它跨膜分子形成復(fù)合受體后才能將細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)。腫瘤壞死因子家族成員p75是NgR重要輔助受體。這些分子與其相應(yīng)受體結(jié)合后最終均會(huì)激活RhoA/ROCK最后共同通路，活化的ROCK通過激活LIM激酶抑制Cofilin蛋白，導(dǎo)致生長(zhǎng)錐萎縮，抑制軸突生長(zhǎng)。這是CNS膠質(zhì)微環(huán)境中上述分子抑制CNS再生的共同信號(hào)通路。因?yàn)閜75缺乏GDP/GTP交換因子結(jié)構(gòu)域，不能直接激活RhoA，需要其他分子

6、介導(dǎo)。蛋白激酶C(protein kinaseC，PKC)就是介導(dǎo)p75細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，從而抑制成年哺乳動(dòng)物CNS軸突生長(zhǎng)的重要分子。蛋白酪氨酸磷酸酶-σ（protein tyrosinephosphatase-σ，PTP-σ)是CSPGs抑制軸突生長(zhǎng)的受體，而CSPGs亦需要激活PKC。因此，PKC是Nogo-A、MAG、Omgp和CSPGs等分子抑制CNS再生的重要調(diào)節(jié)分子。
　　然而，在成年哺乳動(dòng)物CNS再生過程中，PKC是

7、否是RhoA上游分子，文獻(xiàn)報(bào)道不一致。有研究發(fā)現(xiàn)大鼠出生后7d小腦顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，抑制PKC可抑制RhoA活性。而另有研究發(fā)現(xiàn)在大鼠出生后7d小腦神經(jīng)元體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，抑制PKC并不影響RhoA活性。這提示PKC作用的下游信號(hào)分子在不同的神經(jīng)元中可能不一樣。
　　大鼠視神經(jīng)損傷后，包括外傷、炎癥、缺氧等，視網(wǎng)膜核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcripter kapper B，NF-κB)和PKC表達(dá)均明顯增加，

8、抑制PKC或NF-κB的表達(dá)，均能夠明顯減少RGC凋亡數(shù)量。NF-κB是體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與炎癥、癌癥、神經(jīng)元變性、糖尿病、中風(fēng)等一系列病理生理過程。在靜息的細(xì)胞中，NF-κB以無(wú)活性形式存在于胞漿中，當(dāng)細(xì)胞受細(xì)胞外信號(hào)刺激后，激活NF-κB使游離的NF-κB迅速移位到細(xì)胞核，與特異性κB序列結(jié)合，誘導(dǎo)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，這一過程受PKC調(diào)節(jié)。PKC激活NF-κB在許多細(xì)胞生命活動(dòng)過程中起重要作用，例如激活B細(xì)胞受體，活化磷脂酶C，通過P

9、KC激活NF-κB，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，是B細(xì)胞發(fā)揮功能所必須的;應(yīng)用脂肪酸合成抑制劑通過PKC抑制NF-κB可明顯抑制肺癌細(xì)胞增殖。另外，激活NF-κB并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核與DNA結(jié)合在細(xì)胞因子途徑抑制物3(suppressor of cytokine signaling3，SOCS3)表達(dá)過程中其重要作用，而且這一過程受PKC調(diào)控。而敲除SOCS3基因顯著促進(jìn)成年小鼠視神經(jīng)再生。因此，我們推測(cè)抑制PKC可能通過抑制NF-κB，進(jìn)而下調(diào)SOCS3

10、表達(dá)，從而促進(jìn)大鼠視神經(jīng)再生。為此，我們擬通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這一假設(shè)。我們的研究目標(biāo):一是應(yīng)用成年大鼠體坐骨神經(jīng)移植模型和熒光金逆行標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記再生RGCs，探討抑制PKC/NF-κB/SOCS3信號(hào)通路對(duì)成年大鼠視神經(jīng)再生的作用;二是應(yīng)用大鼠RGCs體外培養(yǎng)技術(shù)，培養(yǎng)基中加入可溶性Nogo-A抑制RGCs軸突生長(zhǎng)，闡明髓鞘抑制分子通過PKC調(diào)控NF-κB/SOCS3信號(hào)通路抑制RGCs軸突再生的機(jī)制，為研究髓鞘抑制CNS再生提

11、供一個(gè)新思路。
　　體內(nèi)試驗(yàn):抑制PKC/NF-κ B/SOCS3信號(hào)通路對(duì)成年大鼠視神經(jīng)再生的影響
　　目的:
　　探討抑制PKC/NF-κ B/SOCS3信號(hào)通路對(duì)成年大鼠視神經(jīng)再生的作用。
　　方法:
　　采用自體坐骨神經(jīng)移植模型和熒光金逆行標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記再生RGCs。將61只成年SD大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為:對(duì)照組(n=17)、DMSO組(n=13)、G(o)6976組(n=13)、PDTC組(n

12、=9)、PBS組(n=9)。
　　動(dòng)物干預(yù)方法:
　?、貲MSO組，造模后玻璃體內(nèi)注射5μl DMSO（G(o)6976溶劑），每隔5天一次，直至處死大鼠;
　?、贕(o)6976組，造模后玻璃體內(nèi)注射PKC抑制劑G(o)69765μl（濃度為5μmol/L），每隔5天一次，直至處死大鼠;
　?、跴DTC組，造模后腹腔注射1 mlNF-κB p65抑制劑PDTC（濃度為20 mg/ml），每天一次，直至處死大鼠;

13、
　?、躊BS組，造模后腹腔注射1 ml PBS(PDTC溶劑)，每天一次，直至處死大鼠;
　　⑤對(duì)照組不給予任何上述試劑干預(yù)。自體坐骨神經(jīng)移植術(shù)后4周，每組取5只大鼠采用視網(wǎng)膜平鋪技術(shù)計(jì)數(shù)再生RGC數(shù)量;對(duì)照組剩下12只大鼠進(jìn)行視網(wǎng)膜PKC活性(n=4)、NF-κB p65磷酸化水平(n=4)和SOCS3蛋白表達(dá)水平分析(n=4)，DMSO組和G(o)6976組進(jìn)行視網(wǎng)膜NF-κB p65磷酸化水平(n=4)和SOCS3蛋

14、白表達(dá)水平分析(n=4);PBS組和PDTC組進(jìn)行視網(wǎng)膜SOCS3蛋白表達(dá)水平分析(n=4)。
　　另取12只正常大鼠應(yīng)用PepTag非同位素PKC檢測(cè)試劑盒檢測(cè)視網(wǎng)膜PKC活性(n=4)，應(yīng)用Western blotting分析視網(wǎng)膜NF-κB p65磷酸化水平(n=4)和SOCS3蛋白表達(dá)水平(n=4)。應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey

15、檢驗(yàn);兩組之間比較，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　?、俑鹘M視網(wǎng)膜PKC活性、NF-κB p65磷酸化水平和SOCS3蛋白表達(dá)水平變化:對(duì)照組視網(wǎng)膜PKC活性、NF-κB p65磷酸化水平和SOCS3蛋白表達(dá)水平較正常組均明顯增高(P＜0.05); G(o)6976組視網(wǎng)膜NF-κB p65磷酸化水平和SOCS3蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組均明顯降低(P＜0.05)，但DMSO組與對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)

16、計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）;PDTC組視網(wǎng)膜SOCS3蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組均明顯降低(P＜0.05)，但PBS組與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　?、谝种芇KC對(duì)成年大鼠再生RGCs數(shù)量的影響:對(duì)照組再生RGCs數(shù)量與DMSO組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);G(o)6976組再生RGCs數(shù)量明顯高于對(duì)照組和DMSO組(P＜0.01)。
　?、垡种芅F-κB對(duì)成年大鼠RGCs再生數(shù)量的影響:PBS組再生RGCs數(shù)量與

17、對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05); PDTC組再生RGCs數(shù)量明顯高于對(duì)照組和PBS組(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　成年大鼠視神經(jīng)損傷后，視網(wǎng)膜PKC活性明顯增加，NF-κB p65磷酸化水平明顯升高，SOCS3蛋白表達(dá)水平顯著增高;抑制PKC顯著降低NF-κB p65磷酸化水平，同時(shí)降低SOCS3蛋白表達(dá)水平;抑制NF-κB p65顯著下調(diào)SOCS3表達(dá)。抑制PKC和NF-κB均顯著增加成年大鼠視神經(jīng)損傷后再生RG

18、Cs數(shù)量。這提示抑制PKC可能通過NF-κB介導(dǎo)下調(diào)SOCS3表達(dá)，從而促進(jìn)成年大鼠視神經(jīng)再生。
　　體外實(shí)驗(yàn):PKC/NF-κB/SOCS3信號(hào)通路在Nogo-A抑制體外培養(yǎng)成的年大鼠RGCs軸突生長(zhǎng)中的作用
　　目的:
　　探討PKC/NF-κB/SOCS3信號(hào)通路在體外培養(yǎng)的大鼠RGCs軸突生長(zhǎng)中的作用。
　　方法:
　　應(yīng)用SD幼鼠RGCs體外培養(yǎng)技術(shù)，培養(yǎng)基中加入可溶性Nogo-A抑制RGCs軸突

19、生長(zhǎng)。
　　實(shí)驗(yàn)分組:
　　①正常組，分離出生后1周SD幼鼠RGCs進(jìn)行體外培養(yǎng);
　?、贜ogo-A組，培養(yǎng)基內(nèi)加入可溶性Nogo-A處理;
　?、跥(o)6976組，培養(yǎng)基內(nèi)加入可溶性Nogo-A，同時(shí)加入PKC抑制劑G(o)6976處理;
　?、躊DTC組，培養(yǎng)基內(nèi)加入可溶性Nogo-A，同時(shí)加入NF-κB抑制劑PDTC處理;
　?、軸OCS3-siRNA組，培養(yǎng)基內(nèi)加入可溶性Nogo-A，同時(shí)

20、加入SOCS3 siRNA沉默SOCS3基因表達(dá)。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。
　　應(yīng)用PepTag非同位素PKC檢測(cè)試劑盒檢測(cè)RGCs PKC活性，應(yīng)用Western blotting分析NF-κB p65磷酸化水平和SOCS3蛋白表達(dá)水平;應(yīng)用βⅢ-tubulin免疫組化染色分析RGCs軸突生長(zhǎng)情況，每組每孔測(cè)量50個(gè)RGCs最長(zhǎng)的突起，取平均值。應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差

21、分析，組間多重比較采用Tukey檢驗(yàn);兩組之間比較，采用Mann-whitney U檢驗(yàn);P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　Nogo-A組PKC活性、NF-κB p65磷酸化水平和SOCS3蛋白表達(dá)水平較正常組均明顯增高(P＜0.05);G(o)6976組PKC活性、NF-κB p65磷酸化水平和SOCS3蛋白表達(dá)水平較Nogo-A組均明顯降低(P＜0.05); PDTC組NF-κB p65磷酸化水平和SO

22、CS3蛋白表達(dá)水平較Nogo-A組均明顯降低(P＜0.05)，但是PKC活性與Nogo-A無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);SOCS3-siRNA組SOCS3蛋白表達(dá)水平較Nogo-A組明顯降低(P＜0.01)，但是PKC活性和NF-κB p65磷酸化水平與Nogo-A組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);G(o)6976+PDTC組PKC活性、NF-κBp65磷酸化水平和SOCS3蛋白表達(dá)水平與G(o)6976組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);

23、PDTC+SOCS3-siRNA組NF-κB p65磷酸化水平和SOCS3蛋白表達(dá)水平與PDTC組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，PKC活性與Nogo-A組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　Nogo-A組RGC軸突長(zhǎng)度為較正常組明顯縮短(P＜0.05);G(o)6976組、PDTC組和SOCS3-siRNA組RGC軸突長(zhǎng)度均較Nogo-A組明顯延長(zhǎng)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　Nogo-A可明顯增加體外培養(yǎng)大鼠R