大豆不育系NJCMS1A與保持系NJCMS1B的DNA甲基化比較分析及候選基因的克隆.pdf

1、作物雜種優(yōu)勢(shì)利用是提高產(chǎn)量的一條有效途徑，質(zhì)核互作雄性不育在雜種優(yōu)勢(shì)利用中具有重要作用。盡管諸多學(xué)者對(duì)大豆質(zhì)核互作雄性不育開展了廣泛研究，但其分子機(jī)理仍不清楚。關(guān)于DNA甲基化與質(zhì)核互作雄性不育的關(guān)系在水稻等作物上已有報(bào)道，但在大豆上尚未有相關(guān)報(bào)道，因此本研究擬開展大豆不育系NJCMS1A與其保持系NJCMS1B的DNA甲基化比較分析及候選基因的克隆，獲得主要結(jié)果如下:
　　1、利用MeDIP-seq技術(shù)分別檢測(cè)了大豆質(zhì)核互作雄性

2、不育系NJCMS1A與其保持系NJCMS1B的全基因組DNA甲基化。MeDIP-seq測(cè)序顯示clean reads在染色體上的分布比較均勻，可覆蓋大豆基因組中絕大多數(shù)的CpGs，主要分布于轉(zhuǎn)座元件、啟動(dòng)子、內(nèi)含子等基因組元件。DNA甲基化圖譜分析顯示，NJCMS1A與NJCMS1B的DNA甲基化圖譜相似，其中轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)和轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)(TTS)附近的甲基化水平最低，當(dāng)遠(yuǎn)離上述兩個(gè)位點(diǎn)時(shí)甲基化水平驟然上升，而且基因體的甲基化水

3、平要高于TSS上游2kb和TTS下游2kb區(qū)域。不同基因組元件中的甲基化峰分布表明，轉(zhuǎn)座元件中的甲基化峰數(shù)目最多，而5'UTR、3'UTR和編碼序列(CDS)中的甲基化峰數(shù)目較少，轉(zhuǎn)座元件中又以長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)和末端反向重復(fù)(TIR)發(fā)生甲基化的數(shù)目最多。NJCMS1A與NJCMS1B間共鑒定出178個(gè)差異甲基化基因，其中156個(gè)表現(xiàn)下調(diào)、22個(gè)表現(xiàn)上調(diào)（以NJCMS1B為對(duì)照）。GO功能分析表明，114個(gè)差異甲基化基因注釋到一個(gè)或

4、多個(gè)GO類別，其中有4個(gè)GO term為顯著富集;KEGG代謝通路分析表明，18個(gè)差異甲基化基因參與并富集于同源重組、嘌呤代謝、蛋白酶體、非同源末端連接、嘧啶代謝等通路。此外，利用重亞硫酸鹽測(cè)序技術(shù)對(duì)8個(gè)差異甲基化區(qū)域進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)有6個(gè)差異甲基化區(qū)域的DNA甲基化模式與MeDIP-seq結(jié)果一致，說(shuō)明MeDIP-seq測(cè)序結(jié)果是可靠的。
　　2、綜合MeDIP-seq結(jié)果和前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出GmGST12和GmIscU1

5、-like兩個(gè)候選基因進(jìn)行了克隆和表達(dá)分析。從NJCMS1A和NJCMS1B的花蕾中克隆了GmGST12和GmIscU1-like基因，其ORF分別為708 bp和516bp。生物信息學(xué)分析表明，GmGST12和GmIscU1-like分別編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和鐵硫簇支架蛋白，GmGST12具有GST_N和SCOP兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，GmIscU1-like具有一個(gè)IscU_like保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，GmGST12

6、和GmIscU1-like分別與辣椒CcGST12和蒺藜苜蓿MtISU1的同源性最高，氨基酸序列一致性分別為53％和83.72％。組織表達(dá)分析表明，GmGST12在NJCMS1A花蕾中的表達(dá)水平顯著地高于NJCMS1B，而在根、莖、葉中的表達(dá)沒(méi)有差異，GmIscU1-like在NJCMS1A的根、莖和花蕾中的表達(dá)水平均顯著地高于NJCMS1B，而在葉中的表達(dá)水平卻顯著地低于NJCMS1B。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明GmGST12定位于全細(xì)胞。構(gòu)