農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)法體系優(yōu)化及大豆中一個(gè)WRKY28-like基因的克隆與功能分析.pdf

1、大豆遺傳轉(zhuǎn)化是研究基因功能、培育新品種的一個(gè)重要手段，目前常采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉節(jié)轉(zhuǎn)化法來將外源基因?qū)氪蠖蛊贩N內(nèi)，該方法具有拷貝數(shù)目低、遺傳穩(wěn)定性較高等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也具有基因型依賴性強(qiáng)、伸長率低、篩選困難、褐化現(xiàn)象嚴(yán)重、周期長等缺點(diǎn)。Baby Boom(BBM)是一個(gè)胚胎發(fā)生相關(guān)的基因，可以促進(jìn)細(xì)胞增殖和胚胎發(fā)生，在組織培養(yǎng)條件下能促進(jìn)誘導(dǎo)再生。研究表明在煙草、毛白楊、甜椒等植物中異位表達(dá)BBM可以促進(jìn)轉(zhuǎn)化效率的提高。因此，本研究擬通

2、過在大豆中高表達(dá)BnBBM基因以提高大豆的再生率和轉(zhuǎn)化率;此外，對(duì)大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化過程中的受體基因型、外植體擺放方式、篩選劑濃度、抗氧化劑AgNO3和抗壞血酸Vc的濃度做了比較實(shí)驗(yàn)，希望可以優(yōu)化該轉(zhuǎn)化體系，提高大豆外植體的再生率和最終的轉(zhuǎn)化效率。
　　農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉節(jié)轉(zhuǎn)化法體系優(yōu)化的結(jié)果如下:①以天隆一號(hào)為受體，獲得過表達(dá)BnBBM基因（35S啟動(dòng)子）的T0代轉(zhuǎn)基因株系1株，其T0代和T1代檢測均為陽性，現(xiàn)已收獲666粒T2代種子

3、。關(guān)于BnBBM是否可以提高大豆子葉節(jié)外植體的再生和轉(zhuǎn)化效率有待今后進(jìn)一步驗(yàn)證。②通過比較不同基因型共培養(yǎng)階段的GUS瞬時(shí)表達(dá)率，明確了天隆一號(hào)、Jack紫、大粒黃等為侵染效率高的大豆品種，都高達(dá)94％以上。③發(fā)現(xiàn)外植體切口向上擺放可以顯著提高子葉節(jié)GUS基因的表達(dá)量，Jack紫品種外植體切口向上時(shí)，子葉節(jié)點(diǎn)染色深的概率為11.6％，顯著大于向下時(shí)的6.8％;天隆一號(hào)品種向上擺放時(shí)的染色深概率為63.4％，也顯著大于向下時(shí)的44.6％。

4、④篩選劑草丁膦的濃度梯度實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，草丁膦濃度為7 mg·L-1時(shí)綜合效果最好。⑤繼代培養(yǎng)基中添加不同濃度的Vc或AgNO3實(shí)驗(yàn)表明，Vc和AgNO3雖未能明顯改善外植體的褐化情況，但卻顯著地提高了伸長率和轉(zhuǎn)化效率，添加Vc可使伸長率從7.9％提高到30％,添加AgNO3可以使轉(zhuǎn)化效率從3.2％提高到5.5％。
　　WRKY家族參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、生物與非生物脅迫應(yīng)答等多種過程，AtWRKY28是植物抵抗病原菌和某些非生物逆境

5、所必需的轉(zhuǎn)錄因子。為探討大豆中一個(gè)AtWRKY28同源基因GmWRKY28-like（Glyma14g03280.1）的生物學(xué)功能，本文對(duì)該基因進(jìn)行了克隆、生物信息學(xué)分析、亞細(xì)胞定位、組織表達(dá)等試驗(yàn)，還對(duì)其在ABA、PEG、NaCl脅迫下的表達(dá)水平進(jìn)行了分析，并將GmWRKY28-like轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥中，研究了該基因異位表達(dá)時(shí)的表型變化。
　　結(jié)果顯示:①Gm WRKY28-like基因的編碼區(qū)(CDS)為1008 bp，編

6、碼335個(gè)氨基酸。②GmWRKY28-like蛋白具有保守的WRKY結(jié)構(gòu)域，含有22個(gè)絲氨酸(Serine)、1個(gè)蘇氨酸(Threonine)、2個(gè)酪氨酸(Tyrosine)，不含跨膜結(jié)構(gòu)與信號(hào)肽。③進(jìn)化樹分析表明與其它植物中的WRKY28蛋白相比，大豆GmWRKY28-like與菜豆WRKY28的相似性最高。④亞細(xì)胞定位顯示GmWRKY28-like定位在細(xì)胞核中。⑤該基因在根、種子中表達(dá)量很低，在真葉、花、及莖尖表達(dá)量較高。⑥GmW