聯(lián)苯培養(yǎng)條件下紅球菌R04轉(zhuǎn)錄應(yīng)答及其中間代謝物原兒茶酸的生物轉(zhuǎn)化.pdf

1、隨著對多氯聯(lián)苯（PCBs）生物降解過程中代謝動力學(xué)和代謝機理的研究日趨成熟，人們對多氯聯(lián)苯代謝菌的研究逐漸轉(zhuǎn)移到了基因組和轉(zhuǎn)錄組水平上，基因組和轉(zhuǎn)錄組研究不僅能夠從根本上揭示特定生物學(xué)過程的分子機理，還能直觀監(jiān)測整個細(xì)胞代謝特征，進(jìn)而獲得聯(lián)苯/PCBs脅迫下，微生物相關(guān)細(xì)胞生理調(diào)節(jié)反應(yīng)和聯(lián)苯通路可能存在的輔助機制信息。
　　為了研究不同碳源培養(yǎng)條件下,特別是聯(lián)苯條件下紅球菌的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄應(yīng)答，挖掘與多氯聯(lián)苯（PCBs）轉(zhuǎn)運、代謝及其調(diào)

2、控相關(guān)的基因，為進(jìn)一步全面理解 PCBs微生物降解的分子機制奠定基礎(chǔ)。本課題以一株多氯聯(lián)苯降解菌紅球菌（Rhodococcus sp. R04）為材料，分別提取不同碳源（乙醇、葡萄糖和聯(lián)苯）培養(yǎng)條件下菌體的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。采用高通量測序法分別對這三種樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，分析測序數(shù)據(jù)得出全基因組表達(dá)模式，并對不同條件下的基因表達(dá)進(jìn)行差示分析，進(jìn)而對聯(lián)苯代謝網(wǎng)絡(luò)和紅球菌中其他基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和代謝應(yīng)答反應(yīng)做出相關(guān)性分析。并通過

3、 Q-RT-PCR分析不同碳源培養(yǎng)條件下的基因表達(dá)情況。測序結(jié)果表明，與葡萄糖和乙醇相比，聯(lián)苯培養(yǎng)條件下顯著上調(diào)（log2 Ratio≧1）基因個數(shù)分別為375和332個。與葡萄糖相比，聯(lián)苯培養(yǎng)條件下相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)量與Q-RT-PCR實驗結(jié)果基本一致。功能分類獲得細(xì)胞組分、分子功能和生物學(xué)過程三大類別160多個細(xì)小分支的差示表達(dá)基因，部分基因參與聯(lián)苯代謝轉(zhuǎn)錄調(diào)控、聯(lián)苯轉(zhuǎn)運、抗氧化應(yīng)激反應(yīng)以及信號傳導(dǎo)通路系統(tǒng)等多種生理過程。參與聯(lián)苯上游

4、代謝途徑的眾多同工酶基因中，只有bphC2和bphD1在聯(lián)苯中大量上調(diào)表達(dá)，其余同工酶在聯(lián)苯中基本量不變或下調(diào)表達(dá)。轉(zhuǎn)錄組注釋及差示分析推測，紅球菌 R04中苯甲酸的代謝主要是通過兒茶酚鄰位途徑、間位途徑以及原兒茶酸途徑三條代謝途徑完成。與葡萄糖和乙醇相比，紅球菌 R04在聯(lián)苯培養(yǎng)條件下基因表達(dá)差異明顯，這為我們進(jìn)一步解析多氯聯(lián)苯代謝特征和代謝調(diào)控提供理論依據(jù)。
　　原兒茶酸是多種中藥的主要活性成分和多種藥物的前體物質(zhì)，其生物學(xué)功

5、效具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤、抗炎等作用。目前國內(nèi)市場對原兒茶酸需求量逐年增長，其生產(chǎn)方法主要是采用化學(xué)化工法從植物中抽提，提取工藝復(fù)雜，在多步提取過程中都有不同程度的損耗，提取率低，且對生態(tài)環(huán)境造成一定破壞。本課題從生物轉(zhuǎn)化角度解決原兒茶酸生產(chǎn)工藝中的各種問題，首次運用生物酶催化法生產(chǎn)原兒茶酸。將對羥基苯甲酸-3-羥化酶基因重組表達(dá)在大腸桿菌 BL21(DE3)細(xì)胞中，成功構(gòu)建了一株高效生產(chǎn)原兒茶酸的工程菌，實現(xiàn)了原兒茶酸的綠色催化。此