南海真菌代謝物研究及萎蔫酸銅絡(luò)合物生物合成機(jī)制初探.pdf

1、海洋微生物由于其獨(dú)特的海洋生態(tài)環(huán)境，可以產(chǎn)生豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物。這些化合物往往結(jié)構(gòu)獨(dú)特，并具有各種藥理活性。海洋微生物活性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)是新型藥物的重要來(lái)源，同時(shí)，研究這些次級(jí)代謝產(chǎn)物在微生物體內(nèi)的生物合成途徑具有重要的意義。
　　 本論文分為三大部分。第一部分首先從來(lái)源于廣西山口紅樹林自然保護(hù)區(qū)的13種紅樹的樣品分離純化到的552株內(nèi)生真菌中，通過(guò)形態(tài)和生長(zhǎng)特征挑取了21株形態(tài)上較有代表性的菌株作為初篩對(duì)象，通過(guò)化學(xué)多樣性與藥理活

2、性相結(jié)合的篩選模式，篩選出了兩株活性較好且次級(jí)代謝產(chǎn)物豐富的紅樹林內(nèi)生真菌Phomasp.SK3RW1M與Alternaria sp.SK12JN3L。在接下來(lái)的化學(xué)物質(zhì)研究中，從上述兩株真菌共分離到到6個(gè)新化合物(3-1，3-2，3-3，4-1，4-2，4-3)。
　　 論文第二部分研究了分別從南中國(guó)海內(nèi)生真菌和放線菌中分離得到的已知化合物萎蔫酸和放線菌素Ⅴ的藥理活性。研究表明，萎蔫酸的Cd(Ⅱ)和Cu(Ⅱ)金屬絡(luò)合物分別對(duì)卡

3、介苗和結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株M. tuberculosis H37Rv有較強(qiáng)的抑菌活性，MIC值分別為4μg/ml和10弘g/ml。放線菌素Ⅴ能有效誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，并對(duì)其作用機(jī)理做了初步研究。
　　 論文第三部分探索了萎蔫酸的銅絡(luò)合物(Cu-fusaric acid)在紅樹林內(nèi)生真菌Fusarium oxysporum ZZF51中產(chǎn)生的機(jī)制。根據(jù)我們目前所掌握到的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，我們認(rèn)為Cu2+很可能是ZZF51產(chǎn)生FA有關(guān)的信號(hào)分

4、子，微量的Cu2+喚醒與FA生物合成相關(guān)的沉默基因，或直接激活相關(guān)的調(diào)控蛋白質(zhì)，從而誘導(dǎo)ZZF51在胞內(nèi)代謝產(chǎn)生FA，繼而與Cu2+在細(xì)胞內(nèi)絡(luò)合形成Cu(FA)2。同時(shí)，Cu2+對(duì)于ZZF51這一信號(hào)分子功能是特異性的，與其他金屬離子共存時(shí)，該種信號(hào)功能會(huì)受到一定程度的干擾。
　　 論文第一章首先詳細(xì)介紹了天然產(chǎn)物作為藥物開(kāi)發(fā)的先導(dǎo)化合物源泉在當(dāng)今國(guó)際醫(yī)藥業(yè)界所面臨的挑戰(zhàn)與困難，以及加快天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)進(jìn)程的最新手段。然后系統(tǒng)介紹了

5、當(dāng)今國(guó)際上激活微生物沉默生物合成通路的最新方法，以及調(diào)控微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的前沿手段。
　　 論文第二章從來(lái)源于廣西山口紅樹林自然保護(hù)區(qū)的13種紅樹的樣品分離純化到的552株內(nèi)生真菌中，通過(guò)形態(tài)和生長(zhǎng)特征挑取了21株形態(tài)上較有代表性的菌株作為初篩對(duì)象，通過(guò)化學(xué)多樣性與藥理活性相結(jié)合的篩選模式，篩選出了兩株活性較好且次級(jí)代謝產(chǎn)物豐富的紅樹林內(nèi)生真菌Phoma sp.SK3RW1M與Alternaria sp.SK12JN3L，作為

6、接下來(lái)化學(xué)物質(zhì)研究的對(duì)象。
　　 論文第三章系統(tǒng)研究了紅樹林內(nèi)生真菌Phoma sp.SK3RW1M的代謝產(chǎn)物。從該菌共分離到3個(gè)新化合物，即兩個(gè)新的咕噸酮1-hydroxy-8-hydroxymethyl-6-methoxy-3-methyl-xanthen-9-one(3-1)和1-hydroxy-8-hydroxymethyl-3-methoxy-6-methyl-xanthen-9-one(3-2)，以及一個(gè)新的內(nèi)酯1,

7、8-dihydroxy-10-methoxy-3-methyl-dibenzo[b，e]oxepine-6,11-dione(3-3)，其中化合物3-1獲得了單晶結(jié)構(gòu)。根據(jù)1H NMR，13C NMR，HMBC，HMQC，HREIMS確定了所有化合物的結(jié)構(gòu)。在初步的藥理活性測(cè)試實(shí)驗(yàn)中，上述三個(gè)新化合物對(duì)口腔癌細(xì)胞株KB，多藥抗藥性口腔癌細(xì)胞株KBv200均不顯示活性(IC5o＞50μg/mL)。
　　 論文第四章系統(tǒng)研究了紅樹林

8、內(nèi)生真菌Alternaria sp.SK12JN3L的代謝產(chǎn)物。從該菌中分離到3個(gè)新的蒽醌類化合物，即1,7-dihydroxy-3-methoxy-5-methyl-anthraquinone(4-1)，1-hydroxy-3,7-dimethoxy-5-methyl-anthraquinone(4-2)，和1,3,7-trimethoxy-5-methyl-anthraquinone(4-3)，并首次報(bào)道了已知化合物tetrahyd

9、roaltersolanol B(4-8)的單晶結(jié)構(gòu)。在初步的藥理活性測(cè)試實(shí)驗(yàn)中，上述3個(gè)新化合物對(duì)口腔癌細(xì)胞株KB以及多藥抗藥性口腔癌細(xì)胞株KBv200均不顯示活性(IC5o＞50μg/mL)。
　　 論文第五章報(bào)道了從海南東寨港紅樹林內(nèi)生真菌DZ27中分離到的已知化合物萎蔫酸及其金屬絡(luò)合物的抗結(jié)核菌活性。論文首先用卡介苗作為初篩的受試菌，測(cè)試萎蔫酸的抑菌活性。結(jié)果表明，其MIC值為20μg/mL，具有中等強(qiáng)度的活性。然后從萎

10、蔫酸的結(jié)構(gòu)受到啟發(fā)，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，合成了萎蔫酸的Cu(Ⅱ)，Mn(Ⅱ)，F(xiàn)e(Ⅱ)，F(xiàn)e(Ⅲ)，Zn(Ⅱ)，Pb(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)絡(luò)合物。研究表明，萎蔫酸的Cd(Ⅱ)和Cu(Ⅱ)金屬絡(luò)合物分別對(duì)卡介苗和結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株M. tuberculosisH37Rv有較強(qiáng)的抑菌活性，MIC值分別為4μg/ml和10μg/ml。
　　 論文第六章報(bào)道了從廣東省陽(yáng)江市閘坡海泥放線菌H4126中分離到的大量已知化合物放線菌素Ⅴ的抗腫瘤活

11、性。本論文通過(guò)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)，研究了它的抗乳腺癌作用。結(jié)果證明放線菌素Ⅴ能有效誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。在此過(guò)程中凋亡途徑中的一些關(guān)鍵分子如caspase-8，-9，-3被激活，從而引起PARP蛋白被切割，最終誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。
　　 論文第七章初步探索了萎蔫酸的銅絡(luò)合物(Cu-fusaric acid，略為Cu-FA，下同)在紅樹林內(nèi)生真菌Fusarium oxysporum ZZF51中的生物合成機(jī)制。本研究組譚倪博士曾于2008年在

12、一株紅樹林內(nèi)生真菌Fusarium oxysporum ZZF51的代謝產(chǎn)物中分離到Cu-FA，而本研究組張奕博士隨后從另外一株紅樹林內(nèi)生真菌Fusarium sp.B2的代謝產(chǎn)物中分離到fusaric acid(略為FA，下同)，而在跟ZZF51同樣的培養(yǎng)條件下，卻并未在代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)有Cu-FA。上述現(xiàn)象引起了我們的關(guān)注和極大的興趣。因此我們通過(guò)ZZF51和B2的平行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，試圖探討Cu-FA和FA分別在這兩株菌種產(chǎn)生的機(jī)制。同時(shí)，

13、我們也試圖考察在ZZF51中，F(xiàn)A金屬絡(luò)合物的產(chǎn)生是否特異性地被二價(jià)銅離子所誘導(dǎo)，或者其他金屬離子是否也會(huì)以同樣的方式產(chǎn)生作用。根據(jù)我們目前所掌握到的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，我們認(rèn)為Cu2+很可能是ZZF51產(chǎn)生FA有關(guān)的信號(hào)分子，微量的Cu2+喚醒與FA生物合成相關(guān)的沉默基因，或直接激活相關(guān)的調(diào)控蛋白質(zhì)，從而誘導(dǎo)ZZF51在胞內(nèi)代謝產(chǎn)生FA，繼而與Cu2+在細(xì)胞內(nèi)絡(luò)合形成Cu(FA)2。同時(shí)，Cu2+對(duì)于ZZF51這一信號(hào)分子功能是特異性的，與其他