虎杖組織培養(yǎng)物中白藜蘆醇和虎杖苷的代謝調(diào)控、生物轉(zhuǎn)化及其提取液抗腫瘤活性篩選研究.pdf

1、虎杖(PolygonumcuspidatumSieb.etZucc.)為多年生蓼科草本植物，在我國(guó)廣泛分布于秦嶺以南地區(qū)，根或根莖入藥。藥理學(xué)研究表明，虎杖中所含的白藜蘆醇和虎杖苷，是具有多種藥理作用的活性化合物，被譽(yù)為“二十一世紀(jì)最有前途的抗癌藥物之一”。目前市售的白藜蘆醇和虎杖苷主要是從野生虎杖中提取，極易造成資源匱乏。為了實(shí)現(xiàn)該藥用植物資源的可持續(xù)利用，本人系統(tǒng)地開(kāi)展了虎杖的生物技術(shù)研究，包括組織培養(yǎng)、遺傳轉(zhuǎn)化、活性成分的代謝調(diào)控

2、以及生物轉(zhuǎn)化等，并對(duì)組織培養(yǎng)物提取液的抗腫瘤活性進(jìn)行了初步篩選，取得的主要結(jié)果如下： 1建立了虎杖快速無(wú)性繁殖體系 通過(guò)植物組織培養(yǎng)的方法，建立了適宜擴(kuò)大培養(yǎng)的無(wú)性繁殖體系流程，可在短期內(nèi)持續(xù)收獲優(yōu)質(zhì)虎杖種苗。篩選并確定了誘導(dǎo)幼芽分化的培養(yǎng)基為MS+0.05mg/LTDZ+0.5mg/LNAA；促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)的培養(yǎng)基為MS+0.1mg/LCPPU+1.0mg/LNAA+0.5％活性炭；快速生根及壯苗的培養(yǎng)基為1/2MS+1

3、.0mg/LNAA+0.5％活性炭。以無(wú)菌組培苗幼芽為起始材料，經(jīng)過(guò)器官增殖培養(yǎng)途徑，2～3周內(nèi)可獲得發(fā)育良好的完整植株，繁殖系數(shù)為5～7，煉苗移栽成活率為100％。 2成功誘導(dǎo)愈傷組織并建立了細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系 莖段比葉柄、葉片更容易誘導(dǎo)愈傷組織的形成，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.5mg/LCPPU+0.2mg/LNAA。愈傷組織增殖培養(yǎng)基為SH+0.05mg/LTDZ+1.0mg/LNAA。受到光照、培養(yǎng)基組成等條件的影響，

4、愈傷組織在繼代過(guò)程中可形成生長(zhǎng)速度、形態(tài)特征以及有效成分含量不同的品系。選取黑暗條件下生長(zhǎng)旺盛、結(jié)構(gòu)疏松的白色愈傷組織，經(jīng)過(guò)搖瓶培養(yǎng)和反復(fù)繼代篩選，分離獲得了胚性的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系。 3實(shí)現(xiàn)了虎杖毛狀根的高頻誘導(dǎo)與離體優(yōu)化培養(yǎng) 利用發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，首次實(shí)現(xiàn)了虎杖毛狀根的高頻誘導(dǎo)。以毛狀根的誘根率和誘根密度作為轉(zhuǎn)化效率的評(píng)價(jià)指標(biāo)，探討了感染外植體種類(lèi)、預(yù)處理方式、侵染條件等影響因子，得到優(yōu)化后的高頻誘導(dǎo)流程：

5、從無(wú)菌苗上選取生長(zhǎng)較好的綠色成熟葉片，切成1cm2，不經(jīng)預(yù)培養(yǎng)，放入發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834和根癌農(nóng)桿菌C58混合菌液中，超聲振蕩30s，取出吸干多余菌液，將葉片下表皮接觸培養(yǎng)基并置于暗處進(jìn)行共培養(yǎng)，20d后毛狀根的平均誘根率為98.5％，誘根密度為17.2。PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)所獲毛狀根具有轉(zhuǎn)發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒中rolB及tms基因性質(zhì)。 篩選得到適宜毛狀根離體生長(zhǎng)的條件是：采用1/2MS0液體培養(yǎng)基，pH6.5～7.5，溫度：

6、22～27℃，搖床轉(zhuǎn)速：120～140r·min-1。繼代培養(yǎng)的接種量控制在0.3～0.4gFW毛狀根：100ml培養(yǎng)液。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(如NAA、CPPU、TDZ、Eth)均可不同程度抑制毛狀根的生長(zhǎng)，并可導(dǎo)致愈傷化。黑暗條件下毛狀根呈白色，不易褐化，生長(zhǎng)較快；光照充足時(shí)毛狀根轉(zhuǎn)為粉紅或淺綠色，生長(zhǎng)較慢，根尖容易褐化，因此毛狀根適宜在黑暗或弱光處培養(yǎng)。 毛狀根經(jīng)過(guò)12個(gè)月16次繼代培養(yǎng)，表現(xiàn)出良好的繼代穩(wěn)定性。在30d的培養(yǎng)周

7、期內(nèi)，毛狀根的生長(zhǎng)呈現(xiàn)出典型的“慢—快—慢”S型生長(zhǎng)曲線特點(diǎn)，0～6d為延遲期，6～24d為指數(shù)生長(zhǎng)期，24～30d為靜止期，靜止期后毛狀根逐漸褐化衰老。液體培養(yǎng)的毛狀根日平均增長(zhǎng)量為0.21～0.28gDW/d，30d時(shí)最終收獲量(以鮮重計(jì))是初始接種量的9.2倍，干重增長(zhǎng)率為8.29，分別比自然根及懸培細(xì)胞高出7.4和191.8倍。 4建立了快速準(zhǔn)確的白藜蘆醇和虎杖苷提取、鑒別及含量測(cè)定方法 實(shí)驗(yàn)采用超聲提取、TLC

8、法和RP-HPLC法，對(duì)虎杖野生植株及其組織培養(yǎng)物中白藜蘆醇和虎杖苷進(jìn)行提取、鑒別和含量測(cè)定。 方法學(xué)研究表明：白藜蘆醇在6.2～31.0μg·mL-1線性關(guān)系良好，回歸方程式為Y=1.14×108X-1.489×105(r=0.998)；虎杖苷在4.55～40.9μg·mL-1線性關(guān)系良好，回歸方程式為Y=7.597×107X+8.155×102(r=0.9993)；白藜蘆醇和虎杖苷精密度的RSD分別為0.6％和0.5％；0～

9、8h穩(wěn)定性的RSD分別為1.7％和1.4％；樣品中白藜蘆醇平均含量為0.49％，虎杖苷平均含量為4.55％，重復(fù)性的RSD分別為1.1％和2.0％；白藜蘆醇和虎杖苷的平均回收率分別為98.1％和99.2％，RSD分別為2.5％和1.9％；采用超聲提取法能夠達(dá)到索氏及回流提取效率的91％～93％。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明所建立的方法準(zhǔn)確可靠，符合測(cè)定要求。 5探討了不同組織培養(yǎng)物中有效成分積累的規(guī)律 通過(guò)對(duì)大量組織培養(yǎng)物中白藜蘆醇和虎