玉米優(yōu)良自交系的組織培養(yǎng)和sbeⅡb基因RNAi片段的轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、　本文利用十個常規(guī)優(yōu)良自交系進(jìn)行再生特性和條件的優(yōu)化，開展了玉米淀粉分支酶基因的RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建以及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化研究，獲得了如下主要結(jié)果： 　　1.選用了生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的十個玉米優(yōu)良自交系，通過組織培養(yǎng)研究其再生情況，玉米自交系基因型間的培養(yǎng)能力具有較大的差異，十個玉米自交系都能誘導(dǎo)出初級愈傷組織，但是形成胚性愈傷組織的能力和再生頻率上具有很大的差異﹪。 　　2.選用玉米幼胚、成熟胚、胚葉、胚軸、胚根作為外植體，研究不

2、同外植體誘導(dǎo)愈傷及再生能力情況。其中幼胚誘導(dǎo)初級愈傷組織可達(dá)100﹪，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率也比較高，可達(dá)80﹪，成熟胚的誘導(dǎo)愈傷能力也比較強(qiáng)，但是形成胚性愈傷的能力較差一些，再生頻率只有10﹪左右，而胚根、胚葉等誘導(dǎo)愈傷組織比較困難，且其愈傷組織沒有胚性，幾乎不能分化，分化頻率不足1﹪。 　　3.通過對供試自交系178培養(yǎng)基條件的篩選和優(yōu)化獲得了玉米幼胚合適的誘導(dǎo)培養(yǎng)基；合適的繼代培養(yǎng)基；合適的分化培養(yǎng)基和合適的生根培養(yǎng)基，并建立了以幼

3、胚為外植體的再生體系。 　　4.分別從178自交系玉米基因組中擴(kuò)增了sbeⅡb基因的第20外顯子DNA片段(155bp)和從未成熟種子cDNA中擴(kuò)增了第21、22外顯子DNA片段(280bp)，利用pUCCRNAi與pCAMBIA1300載體作為橋梁載體，分別構(gòu)建了含胚乳特異啟動子HMW和潮霉素篩選基因的RNAi表達(dá)載體pCAMBIA1300+HMW+2F及含bar篩選基因的RNAi表達(dá)載體pCAMBIA1300+bar+HMW+2F

4、。 　　5.利用四個獲得再生的自交系基因組分別擴(kuò)增了sbeⅡb基因的第20外顯子DNA片段并進(jìn)行了測序分析，表明選擇的干涉片段DNA序列具有高度的保守性，構(gòu)建的RNAi表達(dá)載體可適合不同自交系的遺傳轉(zhuǎn)化。 　　6.通過三親雜交將構(gòu)建的載體pCAMBIA1300+HMW+2F導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404，對玉米進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明：以農(nóng)桿菌菌液濃度OD值為0.6，浸染20min，共培養(yǎng)3d，獲得抗性愈傷的頻率最高。同時AS能明顯提高農(nóng)