超級稻組織培養(yǎng)及農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、本文以我校培育出的超級稻沈農(nóng)606和沈農(nóng)265為試材，從成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)，愈傷組織的繼代，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)和原生質(zhì)體的分離，植株再生等方面進(jìn)行了研究，優(yōu)化了沈農(nóng)606和沈農(nóng)265的組織培養(yǎng)條件，建立了高效的植株再生體系。并且以沈農(nóng)265的愈傷組織為受體，進(jìn)行了農(nóng)桿菌介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)化的研究。主要結(jié)果如下： 1．沈農(nóng)606和沈農(nóng)265的成熟胚在以MS為基本培養(yǎng)，添加3mg/L2,4-D，30g/L蔗糖，0.8％瓊脂，pH為5.8的誘

2、導(dǎo)培養(yǎng)上，27℃條件下培養(yǎng)30天，能夠誘導(dǎo)出質(zhì)量較好的愈傷組織，誘導(dǎo)率均可以達(dá)到90％以上。研究還表明生長素2,4-D對愈傷組織的誘導(dǎo)起著主要作用；適量的6-BA和ABA對愈傷組織的誘導(dǎo)起到一定的積極作用，但效果不明顯；蔗糖濃度高于40g/L時，誘導(dǎo)率急劇下降；愈傷組織的誘導(dǎo)受溫度的影響很大；而有無光照對愈傷組織的誘導(dǎo)沒有影響。 2．優(yōu)化出沈農(nóng)606和沈農(nóng)265的愈傷組織繼代培養(yǎng)基為：以N6為基本培養(yǎng)，添加2.5mg/L的2,4

3、-D和500mg/L的脯氨酸，蔗糖濃度為30g/L，瓊脂8g/L，pH為5.8。在這樣的培養(yǎng)上兩個品種的愈傷組織可以快速的生長增殖。沈農(nóng)606的繼代時間為不超過27天，沈農(nóng)265的繼代時間為30天以內(nèi)。在繼代過程中在基本培養(yǎng)基對愈傷組織生長影響顯著，其中N6最有利于愈傷組織生長；培養(yǎng)基中添加細(xì)胞分裂素對愈傷組織的生長沒有促進(jìn)作用；在繼代培養(yǎng)基中添加脯氨酸可以顯著促進(jìn)愈傷組織的生長，而水解酪蛋白和谷氨酰胺作用不顯著；蔗糖濃度對愈傷組織生長

4、影響顯著，30g/L的蔗糖最有利于愈傷組織生長；光照對愈傷組織的增殖沒有影響，但是卻可以影響愈傷組織的生長狀態(tài)，容易使其失去胚性而變白。 3．以N6為基本培養(yǎng)基，添加2mg/L的2,4-D，1000mg/L的脯氨酸，30g/L的蔗糖，pH為5.8的液體培養(yǎng)基有利于沈農(nóng)265細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的生長增殖。細(xì)胞團(tuán)在懸浮培養(yǎng)過程中，生長素和細(xì)胞分裂素對其增殖影響不顯著；而脯氨酸可以顯著促進(jìn)細(xì)胞團(tuán)的生長。以懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞團(tuán)為外植體，利用上海生

5、產(chǎn)的纖維素酶和其他試劑組成的酶液可以成功地分離到原生質(zhì)體。 4．將沈農(nóng)606和沈農(nóng)265懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞團(tuán)，接種于以N6為基本培養(yǎng)基，添加6-BA4mg/L、NAA 0.5mg/L、30g/L蔗糖、0.8％瓊脂的分化培養(yǎng)基上，可以較好的獲得再生植株。細(xì)胞團(tuán)經(jīng)過懸浮培養(yǎng)可以更好的保持胚性，分化能力較強，而愈傷組織長期繼代后失去分化能力。通過對懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞團(tuán)長期繼代培養(yǎng)，可以促進(jìn)細(xì)胞團(tuán)中體細(xì)胞胚的形成，通過體細(xì)胞胚發(fā)生途徑更容易獲得