高糖誘導(dǎo)的NETs在糖尿病腎病中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：糖尿病腎病是目前導(dǎo)致終末期腎病最主要的原因，但其具體發(fā)病機(jī)制尚不明確。中性粒細(xì)胞胞外網(wǎng)絡(luò)（NETs）是中性粒細(xì)胞對抗外源性刺激物的一種防御機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)NETs在肺纖維化、痛風(fēng)、哮喘、糖病足等疾病的進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用，但其是否參與了糖尿病腎病的發(fā)生及其機(jī)制還未闡明。本研究旨在探索NETs在糖尿病腎病中所發(fā)揮的作用及其機(jī)制。
　　方法：在動物實驗中，采用一次性腹腔下注射鏈脲酶素（STZ）150mg/Kg建造糖尿病小鼠模型。常

2、規(guī)喂養(yǎng)32周后收集尿液采用化學(xué)酶促法檢測UACR以確定糖尿病腎病模型是否構(gòu)建成功，并處死小鼠后收集腎臟組織。收集血糖正常及糖尿病腎病的腎臟腫瘤患者的瘤旁組織（距腫瘤5cm處）。PAS染色及天狼星紅染色觀察糖尿病腎病的小鼠與人的腎臟結(jié)構(gòu)損傷情況和腎臟纖維化程度，免疫組織化學(xué)檢測NETs相關(guān)標(biāo)志物MPO、Cit-Histone3以及腎小管區(qū)域的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化情況。在體外實驗中，使用25mmol/L的高糖培養(yǎng)基干預(yù)人中性粒細(xì)胞，Sytox Gr

3、een染色觀察NETs產(chǎn)生情況，并采用dsDNA Quantitfy Kit對NETs定量。進(jìn)一步采用高糖誘導(dǎo)的NETs干預(yù)HK2人腎小管上皮細(xì)胞24h后，Western Blot檢測E-Cadherin、SMA、Snail、ZEB的表達(dá)以判斷細(xì)胞是否發(fā)生了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。
　　結(jié)果：⑴在小鼠糖尿病腎病模型中，STZ組小鼠UACR較對照組顯著上升（4.421±0.351 mg/ml VS3.298±0.187 mg/ml）

4、，差異具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。PAS染色顯示STZ組小鼠的腎臟結(jié)構(gòu)明顯改變，小管區(qū)域基底膜增厚擴(kuò)張、糖原沉積。天狼星紅染色染色表明STZ組較對照組膠原纖維沉積顯著增多，STZ組腎臟明顯纖維化。免疫熒光染色顯示STZ組NETs標(biāo)志物MPO、Cit-Histone3沉積明顯增多，免疫組化顯示STZ組小鼠腎小管區(qū)域E-Cadherin表達(dá)明顯下調(diào)、 -SMA表達(dá)顯著上調(diào)，提示腎臟發(fā)生了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。⑵在人糖尿病腎病組織中，天狼星紅染色

5、顯示腎臟纖維化明顯增加，免疫熒光染色顯示NETs標(biāo)志物MPO、Cit-Histone3沉積明顯增多，免疫組化顯示腎小管區(qū)域E-Cadherin表達(dá)明顯下調(diào)、SMA表達(dá)顯著上調(diào)。⑶在體外實驗中，Sytox-Green熒光染色顯示高糖可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs。Western Blot顯示高糖誘導(dǎo)的NETs干預(yù)人腎小管上皮細(xì)胞后E-Cadherin蛋白顯著下調(diào)，-SMA、Snail、ZEB蛋白顯著上調(diào)。
　　結(jié)論：NETs在糖尿病腎