Tim-3在糖尿病腎病中的表達.pdf

1、目的:
　　糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的常見重要并發(fā)癥。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)2015年的最新數(shù)據(jù)顯示，全球糖尿病患病率為8.8％，中國患病人數(shù)居全球首位。30％～40％的糖尿病患者患有腎病。盡管近年來糖尿病腎病的診斷和治療研究取得很大進展，但是DN的致殘率和死亡率依然居高不下，因而深入研究DN的發(fā)生機制，尋求治療DN的新靶點顯得尤為重要。
　　DN患者存在著長期的免疫系統(tǒng)激活

2、和微炎癥狀態(tài)。多種炎癥因子和免疫細胞參與DN的免疫損傷，炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6和IL-18在糖尿病腎病動物模型中明顯升高，升高的TNF-α、IL-6和IL-18與腎臟指數(shù)及尿蛋白排泄率增加明顯相關(guān)，并且增加血管內(nèi)皮細胞的通透性、介導(dǎo)腎小球肥大、基底膜的增厚，引起內(nèi)皮細胞的凋亡。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)即使DN早期，在腎小球和腎間質(zhì)就有多種免疫細胞（巨噬細胞、T細胞和B細胞等）的浸潤，其中最主要的是巨噬細胞。巨噬細胞在腎臟的聚集

3、會導(dǎo)致腎功能的下降，同時巨噬細胞分泌的炎性產(chǎn)物能誘導(dǎo)和加重炎癥的發(fā)生。巨噬細胞具有極強的異質(zhì)性，在不同環(huán)境刺激下分化為不同表型，發(fā)揮不同功能。眾所周知，巨噬細胞主要有兩種類型:經(jīng)典活化型巨噬細胞(M1)和替代活化型巨噬細胞(M2)。M1主要分泌IL-12及iNOS等促炎因子，在Thl型免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。M2高表達IL-10、CD206、IL-6及Arg-1等分子，表現(xiàn)為抗炎活性，可減輕STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中的巨噬細胞的浸潤。在一

4、定條件下，M1和M2亞型可相互轉(zhuǎn)換。因此如果能找到促進巨噬細胞向M2轉(zhuǎn)化的分子，就有可能找到對DN進行免疫基礎(chǔ)治療的新的作用靶點。
　　Tim-3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-containingmolecule-3)是2002年發(fā)現(xiàn)的新型免疫調(diào)節(jié)分子，最初被認為特異性表達于活化的Th1細胞上，隨后的研究發(fā)現(xiàn)Tim-3廣泛表達于多種固有免疫細胞，如NK、DC、巨噬細胞

5、等。研究證實，Tim-3負向調(diào)控Th1細胞功能，并誘導(dǎo)Th1細胞凋亡，介導(dǎo)免疫耐受的形成，參與多種自身免疫疾病發(fā)生。以上研究充分顯示了Tim-3在免疫負調(diào)控和免疫耐受誘導(dǎo)中的重要作用及其在免疫性疾病治療中的潛在價值。2015年Gut報道，肝細胞肝癌腫瘤微環(huán)境中TGF-β在轉(zhuǎn)錄水平促進巨噬細胞Tim-3表達，并且促進巨噬細胞的M2極化，激活NF-kB通路促進巨噬細胞分泌IL-6,從而促進肝癌細胞的生長，提示Tim-3在組織微環(huán)境中調(diào)控巨噬

6、細胞參與疾病發(fā)生。有報道，在1型糖尿病中，應(yīng)用Tim-3阻斷性抗體(RMT-23)阻斷Gal-9-Tim3途徑可以抑制DC的活化，從而抑制Th1免疫反應(yīng)，提示Tim-3可能參與糖尿病的發(fā)病。那么，Tim-3在糖尿病腎病中的表達及作用機制如何，迄今尚未見報道。本研究以DN患者和動物模型為研究對象，探討Tim-3在DN中的表達。
　　方法與結(jié)果:
　　1.DN患者腎組織Tim-3表達明顯升高
　　免疫組化檢測DN患者腎組織

7、中Tim-3的表達，結(jié)果顯示DN組Tim-3表達明顯升高;免疫組化雙染檢測糖尿病腎病腎穿組織中CD68及Tim-3的表達，結(jié)果顯示CD68與Tim3顯著共定位，且DN腎組織中Tim-3+CD68+細胞數(shù)顯著高于HD組。
　　2.DN患者外周血單核細胞上Tim-3較健康人明顯升高
　　從山東大學(xué)齊魯醫(yī)院收集18例DN患者和16例健康人新鮮外周血，提取單個核細胞，檢測CD14+單核細胞上Tim-3的表達。結(jié)果顯示:DN患者外周血

8、CD14+單核細胞Tim-3表達較健康人明顯升高（P＜0.05)，且M1型單核細胞上Tim-3的表達顯著升高（P＜0.05)，提示單核細胞Tim-3可能通過調(diào)控單核巨噬細胞參與DN免疫損傷。
　　3.DN小鼠腎臟和腹腔巨噬細胞Tim-3表達升高
　　在摘除小鼠一側(cè)腎臟的前提下，應(yīng)用鏈脲佐菌素STZ(50mg/kg，溶于PH=4.45檸檬酸緩沖液)腹腔注射，連續(xù)5天，成功建立小鼠模型，檢測小鼠血肌酐、尿白蛋白肌酐比值、腎組織病

9、理改變（PAS染色）。并用TypeI膠原蛋白酶提取小鼠腎臟單個核細胞，流式檢測F4/80+CD11b+巨噬細胞Tim-3的表達。結(jié)果顯示:模型鼠血糖、尿白蛋白肌酐比值明顯升高，腎組織PAS染色可見模型鼠腎小球系膜基質(zhì)明顯增多;腎臟F4/80+CD11b+巨噬細胞上Tim-3的表達明顯升高;(P＜0.05)。腹腔巨噬細胞上Tim-3的表達明顯上調(diào)(P＜0.05)。我們應(yīng)用WesternBlot方法檢測腎臟Tim-3的表達，同樣發(fā)現(xiàn)DN小鼠

10、腎組織Tim-3表達明顯上調(diào)（P＜0.05），進一步提示Tim-3可能通過調(diào)控單核巨噬細胞參與DN免疫損傷。
　　4.DN小鼠Treg細胞比例下降，Th17細胞比例升高
　　應(yīng)用流式細胞術(shù)分析DN小鼠脾臟單個核細胞中Treg和Th17細胞的比例Treg比例有下降趨勢，Th17細胞比例明顯升高（P＜0.05）;同時應(yīng)用CBA技術(shù)檢測小鼠血清多種炎癥因子的分泌，發(fā)現(xiàn)IL-6有升高趨勢。
　　5.DN小鼠腎組織IL-1β、T

11、NF-α和IL-6表達明顯升高
　　用Trizol法提取腎組織RNA，采用RT-PCR技術(shù)檢測小鼠腎臟IL-1β、TNF-α、IL-6的表達，結(jié)果顯示，與正常對照組相比，DN組小鼠這3種促炎因子的表達均明顯升高。
　　6.Tim-3阻斷可以條調(diào)控巨噬細胞的功能
　　無菌分離DN小鼠腹腔巨噬細胞，提前用Anti-Tim3抗體預(yù)處理后，收集巨噬細胞，流式檢測TNF-α的表達，結(jié)果顯示，Tim-3阻斷后，巨噬細胞TNF-α的