Notch信號(hào)抑制劑和TLR配體聯(lián)合作為佐劑對(duì)呼呼道合胞病毒疫苗增強(qiáng)性免疫病理的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的:呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)是一種副粘病毒科的單股負(fù)鏈RNA病毒，屬于肺炎病毒屬，是引起嬰幼兒下呼吸道感染最重要的病原體之一，嚴(yán)重危害了嬰幼兒的身體健康，在全球范圍內(nèi)，每年大概約有數(shù)百萬(wàn)兒童感染RSV病毒，其中50％以上為小于1歲的嬰兒，患兒可反復(fù)多次感染，嚴(yán)重者可以導(dǎo)致死亡;另外，RSV也是造成老年人群和免疫缺陷者高患病率和死亡率的重要原因。但是，目前尚無(wú)成功有效的疫苗，在二十

2、世紀(jì)六十年代曾研制過(guò)福爾馬林滅活疫苗(FI-RSV)，可惜接種幼兒后導(dǎo)致了嚴(yán)重的肺部疫苗增強(qiáng)性疾病，而且導(dǎo)致兩例死亡?，F(xiàn)在，世界衛(wèi)生組織已把呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗確定為優(yōu)先發(fā)展的疫苗之一。
　　Notch信號(hào)是一種信號(hào)傳導(dǎo)途徑，具高度保守性，其通過(guò)與相鄰細(xì)胞間的互相作用來(lái)調(diào)節(jié)各個(gè)組織和細(xì)胞的分化及發(fā)育，是一條重要的，影響細(xì)胞命運(yùn)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。它幾乎可以涉及調(diào)節(jié)所有細(xì)胞的分化、增殖和凋亡活動(dòng)，因?yàn)槠湔{(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖和凋亡

3、，所以對(duì)一系列生理和病理過(guò)程都有影響。在固有免疫以及適應(yīng)性免疫細(xì)胞的活化、增殖及分化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在哺乳動(dòng)物中，Notch信號(hào)已鑒定出4個(gè)Notch受體(Notch1-4)和5個(gè)配體(Delta1、3、4及Jagged1、2)。Notch信號(hào)可能會(huì)通過(guò)影響疫苗刺激的APC及淋巴細(xì)胞的活性來(lái)調(diào)節(jié)RSV疫苗增強(qiáng)性肺部免疫病理。CpG是TLR-9的配體，通過(guò)激活NF-κB而激活各種免疫細(xì)胞，具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，特別是CpG促進(jìn)DC

4、s產(chǎn)生IFN-γ等細(xì)胞因子，促進(jìn)Th1應(yīng)答，增強(qiáng)CTL活性等。所以，本研究以TLR-9的配體CpG2216和Notch信號(hào)抑制劑作為疫苗FI-RSV的佐劑，通過(guò)抑制小鼠的Notch信號(hào)，來(lái)研究Notch信號(hào)和CpG在RSV疫苗增強(qiáng)性肺部免疫病理中的作用。
　　方法:
　　1、培養(yǎng)Hep-2細(xì)胞，在Hep-2細(xì)胞上培養(yǎng)RSV，測(cè)定RSV滴度。
　　2、制備福爾馬林滅活疫苗(FI-RSV)、福爾馬林滅活加Al(OH)3疫苗

5、(FI-RSV+Al(OH)3)和對(duì)照組疫苗(FI-control)。
　　3、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　3.1小鼠免疫
　　將54只6-9周齡雌性C57B1/6小鼠隨機(jī)分為9組，每組6只，分別為①Control組，不作任何處理;②FI-control組;③FI-RSV組;⑤FI-RSV+Al(OH)3;④FI-RSV+CpG組;⑥FI-control+DMSO組;⑦FI-RSV+L-685,458;⑧FI-RSV+Al(OH)3

6、+L-685,458組;⑨FI-RSV+CpG+L-685，458組，肌肉注射免疫，共免疫2次，每次間隔4周。
　　3.2體液免疫檢測(cè)
　　末次免疫后10天小鼠內(nèi)眥取血，分離血清，用空斑抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血清中和抗體水平，并用ELISA檢測(cè)特異性抗體IgG、 IgG1和IgG2a水平。3.3末次免疫4周后用100μl106pfu/ml的RSV攻擊被免疫小鼠（鼻腔），每天監(jiān)測(cè)被感染小鼠的體重，觀察是否有體重變化。
　　3.45

7、天后處死已攻毒的小鼠，提取組織并做相關(guān)檢測(cè)。3.5做肺組織病理切片，HE染色，觀察炎癥浸潤(rùn)情況;PAS(periodic acidSchiff)染色，觀察氣道粘液分泌情況;實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定肺組織中細(xì)胞因子和RSV-N基因的表達(dá)情況;支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞涂片，觀察炎性細(xì)胞變化情況;檢測(cè)肺組織內(nèi)的病毒滴度，觀察疫苗的保護(hù)情況;ELISA檢測(cè)肺勻漿上清中細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-10、IL-6、IL-13、

8、IL-17的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1、成功培養(yǎng)出RSV，并測(cè)定病毒滴度107.86pfu/ml。
　　2、成功制備福爾馬林滅活疫苗(FI-RSV)、福爾馬林滅活加Al(OH)3疫苗和對(duì)照疫苗(FI-control)。
　　3、小鼠血清中特異性抗體IgG及中和抗體測(cè)定結(jié)果
　　各免疫組產(chǎn)生特異性IgG、IgG1和IgG2a，抗體水平較Control組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各免疫組產(chǎn)生的特異性

9、IgG、IgG1和IgG2a抗體水平與FI-control及FI-control+DMSO組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)，F(xiàn)I-control與FI-control+DMSO組之間比較無(wú)差異。各免疫組誘導(dǎo)的IgG和IgG1無(wú)顯著差異，F(xiàn)I-RSV+CpG+L-685，458組誘導(dǎo)的IgG2a顯著高于其他各免疫組(P＜0.05); FI-RSV+CpG+L-685，458組IgG1/IgG2a的比值(1.02)明顯低于各免疫組(P

10、＜0.05），F(xiàn)I-RSV+Al(OH)3+L-685，458的比值(1.44)高于各免疫組，其它各組比較無(wú)差異。
　　各免疫組產(chǎn)生的中和抗體水平顯著高于FI-control及FI-control+DMSO組(P＜0.05)，F(xiàn)I-control與FI-control+DMSO組之間比較無(wú)差異。另外，F(xiàn)I-RSV組顯著高于FI-RSV+L-685，458(P＜0.05)，F(xiàn)I-RSV+Al(OH)3組顯著高于FI-RSV+Al(O

11、H)3+L-685，458(P＜0.05)，F(xiàn)I-RSV+CpG與FI-RSV+CpG+L-685，458組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4、RSV感染后小鼠的體重變化
　　與Control組相比，F(xiàn)I-RSV+CpG+L-685，458組在各時(shí)間點(diǎn)的體重變化均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）;而其他各免疫組在不同的時(shí)間點(diǎn)均有不同程度的下降，其中FI-RSV+CpG和FI-RSV+L-685，458組在攻擊后第二天體重減低達(dá)到峰值

12、，且顯著低于Control組(P＜0.05); FI-RSV、FI-RSV+Al(OH)3和FI-RSV+Al(OH)3+L-685，458組分別于攻毒后1、3和5天體重減少達(dá)到峰值，分別顯著低于Control組(P＜0.05）;另外，與各免疫組相比FI-RSV+CpG組體重下降最明顯，攻毒后1、2、3天均顯著低于其它各組(P＜0.05); FI-RSV+L-685，458與FI-RSV比較各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05); FI

13、-RSV+Al(OH)3+L-685，458組于1、2天均顯著高于FI-RSV+Al(OH)3組;FI-RSV+Al(OH)3與FI-RSV組各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著差異;這些結(jié)果說(shuō)明:L-685，458單獨(dú)與FI-RSV聯(lián)用對(duì)體重減輕無(wú)影響，CpG單獨(dú)作為佐劑加劇了體重減輕，而CpG與L-685，458聯(lián)合作為FI-RSV的佐劑可完全糾正體重減輕;另外，Al(OH)3佐劑不能改善體重減輕，Al(OH)3與L-685，458聯(lián)合作為FI-RSV

14、的佐劑可部分糾正體重減輕。
　　5、肺組織染色
　　5.1 PAS染色的肺組織切片顯示
　　與Control組相比FI-control組、FI-RSV組、FI-control+DMSO組、FI-RSV+Al(OH)3、FI-RSV+Al(OH)3+L-685，458 RSV攻擊后均呈現(xiàn)出不同程度的粘液分泌，其中FI-RSV+Al(OH)3、FI-RSV+Al(OH)3+L-685，458組呈現(xiàn)大量的粘液分泌，F(xiàn)I-RS

15、V+CpG、FI-RSV+CpG+L-685，458組粘液分泌不明顯。
　　5.2 HE染色的肺組織切片顯示
　　Control組小鼠，肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，無(wú)水腫，肺泡周圍僅有少量白細(xì)胞;FI-control、FI-control+DMSO組和FI-RSV組小鼠支氣管周圍、血管周圍和肺泡間質(zhì)炎性細(xì)胞增多，肺泡壁輕微增厚;FI-RSV+CpG組、FI-RSV+Al(OH)3、FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458與FI-

16、RSV+L-685,458組小鼠經(jīng)RSV攻擊后肺部顯示炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁也明顯增厚，肺泡間甚至出現(xiàn)融合和水腫，并且偶見(jiàn)出血點(diǎn)，其中多為淋巴細(xì)胞，有時(shí)可見(jiàn)單核-巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性性粒細(xì)胞等;FI-RSV+CpG+L-685，458組肺泡間質(zhì)未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁正常，支氣管和血管周圍偶見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞。
　　6、實(shí)時(shí)定量檢測(cè)細(xì)胞因子
　　6.1檢測(cè)肺組織內(nèi)RSV管家基因RSV-N的表達(dá)量FI-control組、FI

17、-control+DMSO組和FI-RSV組肺組織RSV-N基因的表達(dá)量顯著高于其他免疫組（P＜0.05）;另外，F(xiàn)I-RSV+CpG+L-685，458組的表達(dá)量顯著低于FI-RSV+CpG組和FI-RSV+L-685，458組。
　　6.2.1 IFN-γ
　　FI-RSV+CpG、FI-RSV和FI-RSV+Al(OH)3組的IFN-γ顯著高于其它各組儼＜0.05）。
　　6.2.2 IL-4
　　Cont

18、rol組和FI-RSV+Al(OH)3+L-685，458組的IL-4明顯高于其它各組（P＜0.05），其他各組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。
　　6.2.3 IL-5
　　IL-5的表達(dá)量FI-RSV+CpG+L-685，458組顯著低于FI-RSV+CpG組和FI-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458組(P＞0.05)。
　　6.2.4 IL-10
　　FI-control

19、組、FI-RSV組和FI-RSV+Al(OH)3+L-685，458組IL-10的表達(dá)量顯著高于其它各組(P＜0.05);另外，F(xiàn)I-RSV+CpG+L-685，458組的表達(dá)量顯著低于FI-RSV+CpG組（P＜0.05）。
　　6.2.5 IL-13
　　各免疫組IL-13的表達(dá)量顯著高于Control組(P＜0.05);另外，F(xiàn)I-RSV+CpG+L-685，458組的表達(dá)量顯著低于FI-RSV+CpG組、FI-RSV

20、+L-685，458組（P＜0.05）。
　　6.2.6 IL-1β
　　FI-control組、FI-RSV+CpG組IL-1β的表達(dá)量顯著高于其他各組(P＜0.05）;另外，F(xiàn)I-RSV+CpG+L-685，458組的表達(dá)量顯著低于FI-RSV組、FI-RSV+L-685,458組(P＜0.05)。
　　6.2.7 IL-17
　　FI-RSV+CpG組IL-17的表達(dá)量顯著高于除FI-control組、FI

21、-RSV組之外的其他各組(P＜0.05），F(xiàn)I-RSV組顯著高于FI-RSV+Al(OH)3+L-685，458組、FI-RSV+L-685,458組、FI-RSV+CpG+L-685,458組(P＜0.05）。6.2.8 TNF-α
　　FI-RSV+Al(OH)3+L-685，458組和FI-RSV+Al(OH)3組TNF-α的表達(dá)量顯著高于其他各組（P＜0.05）;另外，F(xiàn)I-RSV+CpG+L-685，458組的表達(dá)量顯著

22、低于FI-RSV組、FI-RSV+CpG組(P＜0.05）。
　　6.2.9T-bet
　　FI-RSV+CpG組T-bet的表達(dá)量顯著高于其他組(P＜0.05);FI-control+DMSO組的表達(dá)量顯著高于Control組(P＜0.05）。
　　6.2.10 ROR-γt
　　FI-RSV+CpG組ROR-γt顯著高于其他各組（P＜0.05）;FI-RSV+CpG+L-685，458組的表達(dá)量顯著低于FI-

23、RSV組、FI-RSV+L-685，458組(P＜0.05）。
　　6.2.11GATA-3
　　FI-RSV+Al(OH)3+L-685，458組和FI-RSV+Al(OH)3組GATA-3的表達(dá)量顯著高于其他各組(P＜0.05); FI-RSV+CpG+L-685，458組的表達(dá)量顯著低于FI-RSV組、FI-RSV+CpG組(P＜0.05）。
　　7、支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞涂片
　　7.1各免疫組小鼠支氣管肺

24、泡灌洗液中的細(xì)胞總數(shù)和Control有顯著差異(P＜0.05）， FI-RSV+CpG組高于其他各組(P＜0.05);FI-RSV+CpG+L-685，458組低于除FI-control組、FI-RSV組外的其他各組(P＜0.05)。正常對(duì)照組有差異顯著（P＜0.05），F(xiàn)I-RSV+CpG+L-685，458組顯著高于除FI-RSV+L-685，458組外的其他各組(P＜0.05)。
　　7.3各免疫組小鼠感染RSV5天后支氣管

25、肺泡灌洗液中的淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和正常對(duì)照組有差異顯著(P＜0.05)，F(xiàn)I-RSV+CpG+L-685，458組顯著低于除FI-RSV+Al(OH)3+L-685，458組、FI-RSV+L-685，458組外的其他各組(P＜0.05、)。
　　7.4各免疫組小鼠感染RSV5天后支氣管肺泡灌洗液中的中性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和正常對(duì)照組有差異顯著（P＜0.05），F(xiàn)I-RSV+CpG+L-685，458組顯著低于FI-RSV組、FI-RSV+

26、CpG組、FI-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+Al(OH)3+L-685，458組（P＜0.05）。
　　8、肺勻漿病毒滴定
　　病毒滴定結(jié)果顯示:Control組未檢測(cè)到病毒;其余各免疫組有一定的病毒滴度，但各免疫組的病毒滴度均顯著低于FI-control組、FI-control+DMSO組(P＜0.05); FI-control組與FI-control+DMSO組的病毒滴度無(wú)顯著差異（P＞0.05）。
　

27、　9、ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子
　　9.1 IFN-γ
　　各免疫組IFN-γ的表達(dá)量顯著高于Control組(P＜0.05）;FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458組、FI-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+CpG+L-685，458組、FI-RSV+L-685，458組低于FI-control組（P＜0.05）;另外，F(xiàn)I-RSV+CpG+L-685，458組低于FI-RSV組、FI-RSV+CpG組(P＜

28、0.05）。
　　9.2 IL-1β
　　FI-RSV組IL-1β的表達(dá)量顯著高于其他各組;FI-RSV+Al(OH)3+L-685，458組低于FI-RSV+CpG+L-685，458組(P＜0.05);FI-RSV+CpG+L-685，458組低于FI-RSV+CpG組(P＜0.05）。
　　9.3 IL-4
　　各免疫組IL-4的表達(dá)量顯著高于Control組(P＜0.05）;FI-RSV+CpG+L-68

29、5，458組低于FI-RSV組、FI-RSV+CpG組(P＜0.05)。9.4 IL-6
　　除FI-RSV+Al(OH)3+L-685，458組、FI-RSV+CpG+L-685，458組外，各組IL-6表達(dá)量顯著高于Control組(P＜0.05);另外，F(xiàn)I-RSV+CpG+L-685，458組低于FI-RSV組、FI-RSV+CpG組(P＜0.05)，F(xiàn)I-RSV+CPG組低于FI-RSV組(P＜0.05)。
　　9

30、.5 IL-10
　　除FI-RSV+Al(OH)3+L-685，458組、FI-RSV+L-685，458組外，各組IL-10表達(dá)量顯著高于Control組(P＜0.05);另外，F(xiàn)I-RSV+CpG+L-685，458組低于FI-RSV組、FI-RSV+CpG組（P＜0.05）。
　　9.6 IL-13
　　除FI-control組、FI-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458組

31、外，各組IL-13表達(dá)量顯著高于Control組(P＜0.05)，另外，F(xiàn)I-RSV+CpG+L-685，458組低于FI-RSV組、FI-RSV+CpG組（P＜0.05）。
　　9.7 IL-17
　　FI-RSV組、FI-RSV+CpG組IL-17表達(dá)量顯著高于Control組、FI-control組、 FI-control+DMSO組、 FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458組(P＜0.05);另外，F(xiàn)I-R

32、SV+CpG+L-685，458組低于FI-RSV組、FI-RSV+CpG組（P＜0.05）。
　　9.8TNF-α
　　除FI-RSV+L-685，458組、FI-RSV+Al(OH)3+L-685，458組外其他各組TNF-α的表達(dá)量顯著高于Control組(P＜0.05); FI-RSV+L-685，458組低于FI-control組、FI-RSV組、FI-RSV+CpG組、FI-control+DMSO組(P＜0.0

33、5);另外， FI-RSV+CpG+L-685，458組低于FI-RSV組、FI-RSV+CpG組（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1、CpG與L-685，458作為聯(lián)合佐劑對(duì)IgG抗體和中和抗體的效價(jià)無(wú)顯著影響，但可明顯增加IgG2a的效價(jià)，使IgG1/IgG2a更平衡。
　　2、CpG與L-685，458作為聯(lián)合佐劑對(duì)疫苗的保護(hù)性無(wú)顯著影響，即不降低疫苗的保護(hù)性。
　　3、CpG與L-685，458作為聯(lián)合