基于非天然氨基酸的蛋白質(zhì)定點(diǎn)同位素標(biāo)記及NMR研究.pdf

1、在生命體中存在的蛋白質(zhì)由20種天然氨基酸組成，具有廣泛的種類(lèi)和作用，是生物體行使其功能最重要的大分子之一。近年來(lái)，利用非天然氨基酸(Unnaturalamino acid，UAA)標(biāo)記蛋白位點(diǎn)，對(duì)蛋白進(jìn)行修飾的方法得到廣泛應(yīng)用。通過(guò)不同方法將UAA引入到蛋白中，為人們進(jìn)一步了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、蛋白間相互作用、蛋白動(dòng)力學(xué)以及修飾改造蛋白質(zhì)等方面研究提供了行之有效的方法。本論文共分為四章。
　　第一章首先介紹了非天然氨基酸的合成方法，即通

2、過(guò)有機(jī)合成或通過(guò)酶催化法合成非天然氨基酸。有機(jī)合成法是大量獲得（毫克級(jí)到克級(jí)）非天然氨基酸的有效手段。而酶催化法利用TPL酶或其突變體，用于一些酪氨酸類(lèi)似非天然氨基酸的合成，是有機(jī)合成法的補(bǔ)充。然后，依據(jù)非天然氨基酸功能介紹他們的分類(lèi)情況，包括化學(xué)活性類(lèi)、翻譯后修飾類(lèi)、生物物理探針類(lèi)、金屬螯合類(lèi)等。通過(guò)已有報(bào)道，闡明了非天然氨基酸的重要性。最后，簡(jiǎn)要介紹了非天然氨基酸標(biāo)記蛋白質(zhì)的方法，主要是氨基酸特異性和位點(diǎn)特異性表達(dá)含有非天然氨基酸的

3、蛋白質(zhì)。雖然化學(xué)合成法是獲得均一性蛋白質(zhì)的不錯(cuò)選擇，但多數(shù)報(bào)道中，獲得非天然氨基酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)方法主要是通過(guò)細(xì)胞表達(dá)獲取。
　　第二章首先介紹了光敏非天然氨基酸(photo-caged amino acid)的應(yīng)用。利用賴(lài)氨酸、絲氨酸、酪氨酸和半胱氨酸側(cè)鏈的化學(xué)活性與鄰硝基芐基類(lèi)基團(tuán)連接，得到含有photo-cage的非天然氨基酸。它們通過(guò)位點(diǎn)特異性引入目的蛋白的活性位點(diǎn)后，可以封閉蛋白酶的活性。經(jīng)過(guò)紫外光照射可以將光敏感基團(tuán)脫除

4、，從而得到和天然蛋白酶無(wú)任何差異的活性蛋白酶，達(dá)到調(diào)控酶活性的目的。該方法可以調(diào)控蛋白表達(dá)、信號(hào)傳導(dǎo)等多種生物過(guò)程。之后介紹了由酪氨酸發(fā)展得到的光敏感非天然氨基酸oNBTyr，講述了oNBTyr利用密碼子擴(kuò)增方法位點(diǎn)特異性引入蛋白的發(fā)展過(guò)程。
　　第三章中，先簡(jiǎn)單介紹了液體核磁共振技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)研究的基本方法。在核磁共振研究中，經(jīng)常只需要針對(duì)一個(gè)位點(diǎn)的信號(hào)變化進(jìn)行分析即可。所以在拿到相關(guān)譜圖后，我們往往需要進(jìn)行繁瑣且復(fù)雜的信號(hào)峰

5、歸屬工作。如果能發(fā)展出一種在不影響蛋白結(jié)構(gòu)和功能的情況下，對(duì)蛋白單一位點(diǎn)進(jìn)行同位素標(biāo)記的方法，那么將極大地簡(jiǎn)化核磁分析過(guò)程。以酪氨酸位點(diǎn)的核磁分析為例，我們首先優(yōu)化了oNBTyr的化學(xué)合成，合成產(chǎn)率由原先的21％提高至81％。隨后，利用15N-oNBTyr分別標(biāo)記在GB1和PYL10蛋白的酪氨酸位點(diǎn)(GB1-33Tyr和PYL10-116Tyr)，并在光照脫光敏基團(tuán)后進(jìn)行核磁數(shù)據(jù)采集和分析。證明了利用光敏非天然氨基酸進(jìn)行蛋白質(zhì)酪氨酸位點(diǎn)

6、同位素標(biāo)記的可行性。為其他類(lèi)似的光敏非天然氨基酸應(yīng)用提供了借鑒。
　　第四章介紹了已有報(bào)道的熒光類(lèi)非天然氨基酸的化學(xué)合成方法以及他們的應(yīng)用。著重介紹了非天然氨基酸Anap的發(fā)展，以及L，D-Anap的合成方法。Anap首次被Peter Schultz于2009年報(bào)道，其合成路線復(fù)雜、產(chǎn)率低(8.5％)，而且其合成得到的是D，L-Anap（外消旋體）。我們?cè)O(shè)計(jì)出了合成手性異構(gòu)的L-Anap合成路線，以2-溴代萘和N-三苯甲基-絲氨酸