氨基酸同位素標(biāo)記技術(shù)在肝癌疾病蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用.pdf

1、肝癌是世界上發(fā)生最廣的癌癥之一，在我國也是一種常發(fā)生的惡性腫瘤。肝癌早期癥狀隱匿，不容易察覺，絕大部分患者一旦確診往往已屬于晚期，或者在手術(shù)后較短時間內(nèi)轉(zhuǎn)移到其他器官，導(dǎo)致死亡。探討肝癌相關(guān)分子及分子機制，尋找肝癌的生物標(biāo)記物和治療的靶分子，對于惡性腫瘤的診斷和治療具有重要的理論指導(dǎo)和臨床應(yīng)用意義。利用定量蛋白質(zhì)組技術(shù)從全基因組水平來研究生物學(xué)現(xiàn)象，比較肝癌細胞系和肝細胞系以及比較具有不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細胞系的蛋白質(zhì)組差異，將有助于對肝

2、癌機理的理解，最終指導(dǎo)肝癌診斷和治療。 本論文以氨基酸同位素標(biāo)記技術(shù)(AACT/SILAC)為技術(shù)平臺，首先發(fā)展了一種判斷標(biāo)記肽假陽性的方法，剔除假陽性標(biāo)記肽對定量的影響，改進了氨基酸同位素標(biāo)記技術(shù)。最后選擇了具有相同遺傳學(xué)背景的兩對細胞系，研究了肝癌及轉(zhuǎn)移過程中蛋白質(zhì)組的差異，獲得一批潛在的肝癌分子標(biāo)志物。此外本論文初步研究了不同搜索軟件對定量結(jié)果的影響，為定量蛋白質(zhì)組研究選擇搜索軟件提供依據(jù)(見附錄)。 本論文的第一

3、部分綜述了定量蛋白質(zhì)組研究的發(fā)展情況，首先對質(zhì)譜儀器做了介紹，然后介紹了各種定量方法，比較了各個方法的優(yōu)缺點。 本論文的第二部分改進了氨基酸同位素標(biāo)記技術(shù)，并研究了同肝癌及轉(zhuǎn)移有關(guān)的差異蛋白質(zhì)組，具體包括： (一)標(biāo)記肽假陽性的判斷本部分發(fā)展了一種判斷氨基酸同位素標(biāo)記方法中標(biāo)記肽假陽性的方法，計算出不同標(biāo)記效率下的理論同位素分布，利用最小二乘法擬合得到標(biāo)記肽的標(biāo)記效率，根據(jù)假陽性閾值來判斷標(biāo)記肽的假陽性。本方法經(jīng)實際應(yīng)用

4、，證明簡單易行可靠。 (二)高轉(zhuǎn)移肝癌細胞系的表達譜蛋白質(zhì)表達譜是了解肝癌的分子基礎(chǔ)，在本實驗中，利用SDS-PAGE分離結(jié)合LC-MALDI-MS鑒定技術(shù)，獲得了高轉(zhuǎn)移肝癌細胞系MHCC97H的蛋白質(zhì)表達譜，系統(tǒng)分析了MHCC97H的蛋白質(zhì)表達譜特點。本部分研究首先分析了表達譜的分子量和pI等，顯示了本方法在鑒定具有極端分子量和pI的蛋白質(zhì)方面具有的優(yōu)勢，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的細胞定位和其pI之間有一定的關(guān)聯(lián)，利用GeneOntolog

5、y在三個方面對表達譜蛋白做了GO注釋，并利用InterPro數(shù)據(jù)庫分析了表達譜的蛋白質(zhì)家族特性。根據(jù)KEGG的數(shù)據(jù)和HPRD中的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)，分析了表達譜蛋白所涉及的KEGG通路和蛋白質(zhì)相互作用。 (三)肝癌差異譜的研究本部分試驗比較了肝癌細胞系QGY-7703和肝細胞系QSG-7701的蛋白質(zhì)組差異，鑒定到一批和肝癌有關(guān)的蛋白質(zhì)分子，這些蛋白質(zhì)分子在細胞凋亡、增殖和細胞移動中發(fā)揮著重要的作用，借助Westernblott

6、ing和免疫組化驗證了定量結(jié)果的準(zhǔn)確性和在臨床樣本中差異蛋白的表現(xiàn)。同時本部分研究利用GeneOntology、KEGG、蛋白質(zhì)相互作用分析了差異蛋白的生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)多個差異蛋白參與糖酵解和三羧酸循環(huán)等能量代謝，差異蛋白在MAPK、鈣離子通路、Wnt等信號通路中也發(fā)揮作用。此外討論了熱激蛋白、過氧化物還原蛋白、膜聯(lián)蛋白、角蛋白等在肝癌中的生物學(xué)功能。 (四)肝癌轉(zhuǎn)移差異譜的研究本部分試驗利用AACT/SILAC技術(shù)比較了具有高

7、轉(zhuǎn)移能力的肝癌細胞系MHCC97H和低轉(zhuǎn)移能力的肝癌細胞系MHCC97L的蛋白質(zhì)組差異。利用Westernblotting技術(shù)，在5個具有不同轉(zhuǎn)移能力的肝癌細胞系中，檢驗了差異蛋白和肝癌轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系，同時也比較了差異蛋白在肝癌臨床樣本和癌旁組織的表達差異。利用生物信息工具，分析了差異蛋白的GeneOntology、KEGG通路和蛋白質(zhì)相互作用，并在細胞增殖和凋亡、細胞移動及血管生成等方面討論了差異蛋白的生物學(xué)功能，揭示他們在肝癌轉(zhuǎn)移過