第14章.同位素標(biāo)記技術(shù)在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的應(yīng)用

1、第14章.同位素標(biāo)記技術(shù)在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用,中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)齊孟文,標(biāo)記探針,探針（proble) 帶有檢測(cè)標(biāo)記的，與被檢測(cè)目標(biāo)物分子具有特異性互補(bǔ)反應(yīng)性能的探測(cè)物分子或分子片斷。探針類別 核酸探針 DNA、RNA 探針 非核酸探針，抗體、蛋白質(zhì)分子標(biāo)簽等,,核酸探針,標(biāo)記類別,標(biāo)記核素,標(biāo)記單體,摻入DNA探針的常用單體標(biāo)記化合物 [?-32p]dA

2、TP，[?-32p]dCTP ， [?-32p]UTP ，[?-32p]ATP 。國(guó)內(nèi)供應(yīng)商：北京福瑞 國(guó)外供應(yīng)商： UK,標(biāo)記單體,在分子克隆操作中用于標(biāo)記核酸分子的標(biāo)記物主要是放射性同位素，如32P，33P和35S 。在摻入核苷酸的標(biāo)記過程中，只有三磷酸核苷酸的α位磷酸整合到核酸鏈中，因此使用 α 位磷酸被標(biāo)記的三磷酸核苷酸，如 [ α- 32 P]dATP 。而在標(biāo)記 5' 末端磷酸基團(tuán)的反應(yīng)中一般使用γ位磷酸

3、被標(biāo)記的 ATP 。放射性的信號(hào)通過X- 光片放射自顯影或磷屏掃描獲取。,核酸探針標(biāo)記法,1.雙鏈DNA探針 ⑴ 切口平移法 首先用DNAase I 在探針DNA雙鏈上造成缺口，然后借助于E.coli DNA聚合酶I的5`→3`外切酶活性，切去帶有5`-磷酸的核苷酸；同時(shí)利用該酶5`→3`聚合酶活性，使同位素標(biāo)記的互補(bǔ)核苷酸補(bǔ)入缺口。 這兩種活性同時(shí)作用，缺口不斷向3`方向移動(dòng)，DNA鏈上的核苷酸不斷為標(biāo)記的

4、核苷酸取代，成為帶有標(biāo)記的DNA，純化除去游離脫氧核苷酸后成為標(biāo)記DNA探針。最合適的切口平移片段一般為50-500個(gè)核苷酸,產(chǎn)生均勻標(biāo)記的探針。切口平移反應(yīng)受幾種因素的影響: (a) 產(chǎn)物的比活性取決于[α-32 P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置換的程度。(b) DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶的質(zhì)量會(huì)影響產(chǎn)物片段的大小。(c) DNA模板中的抑制物如瓊脂糖會(huì)抑制酶的活性, 故應(yīng)使用仔細(xì)純化后的DNA。,,,切口平移

5、法,(2)隨機(jī)引物法 通過熱變性使模板DNA 變?yōu)閱捂淒NA，隨機(jī)引物與單鏈DNA退火后，利用Klenow Fragment合成互補(bǔ)鏈。此時(shí)如果底物中dNTP的一種或幾種被 [α-32P], [α-35S], [3H] 等標(biāo)記時(shí)，那么合成的互補(bǔ)鏈DNA也被標(biāo)記。合成后的雙鏈DNA通過熱變性變成單鏈后即可用作雜交探針。,,隨機(jī)引物 法,DNA標(biāo)記法比較：,2.單鏈DNA探針,⑴ 從M13載體衍生序列合成單鏈DNA探針

6、 M13噬菌體是一種單鏈DNA噬菌體，但它在感染宿主（大腸桿菌）后，在菌體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制成為雙鏈并繁殖，又以單鏈形式透出菌體，再度感染新的宿主菌。 將模板序列克隆到M13噬菌體,以特定的同用引物或人工合成寡合苷酸為引物，在[?-32P]dNTP存在下，由Klenow片斷 酶促合成標(biāo)記探針，反應(yīng)完畢后，酶切長(zhǎng)短不一的產(chǎn)物，然后通過變性凝膠電泳與模板分離。,,⑵ 從RNA合成單鏈cDNA探針 用RNA為模板合成cDNA探針

7、所用的引物有兩種: a. 寡聚dT為引物合成cDNA探針。本方法只能用于帶Poly(A)的mRNA,并且產(chǎn)生的探針極大多數(shù)偏向于mRNA 3‘末端序列。 b. 可用隨機(jī)引物合成cDNA探針。該法可避免上述缺點(diǎn),產(chǎn)生比活性較高的探針。但由于模板RNA中通常含有多種不同的RNA分子,所得探針的序列往往比以克隆DNA為模板所得的探針復(fù)雜得多, 應(yīng)預(yù)先盡量富集mRNA中的目的序列。反轉(zhuǎn)錄得到的產(chǎn)物RNA/DNA雜交雙鏈經(jīng)堿變性

8、后,RNA單鏈可被迅速地降解成小片段,經(jīng)Sephadex G-50柱層析即可得到單鏈探針。,3.寡核苷酸探針,若只知道待分離的目的基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，而對(duì)其核苷酸序列一無所知，即可設(shè)計(jì)合成寡核苷酸探針。 利用寡核苷酸探針可檢測(cè)到靶基因上單個(gè)核苷酸的點(diǎn)突變。 單一已知序列的寡核苷酸探針. 種類 許多兼并性寡核苷酸探針組成的寡核苷酸探針庫(kù).,,4.RNA探針,許多載體如p

9、Bluescript, pGEM等均帶有來自噬菌體SP6或E.coli噬菌體T7或T3的啟動(dòng)子,它們能特異性地被各自噬菌體編碼的依賴于DNA的RNA聚合酶所識(shí)別,合成特異性的RNA。在反應(yīng)體系中若加入經(jīng)標(biāo)記的dNTP，則可合成RNA探針。 RNA探針一般都是單鏈,它具有單鏈DNA探針的優(yōu)點(diǎn),又具有許多DNA單鏈探針?biāo)鶝]有的優(yōu)點(diǎn)，主要是： RNA:DNA雜交體比DNA:DNA雜交體有更高的穩(wěn)定性,所以在雜交反應(yīng)中RNA探針比相

10、同比活性的DNA探針?biāo)a(chǎn)生信號(hào)要強(qiáng)。 RNA:RNA雜交體用RNA酶A酶切比S1酶切DNA:RNA雜交體容易控制,所以用RNA探針進(jìn)行RNA結(jié)構(gòu)分析比用DNA探針效果。,5.末端標(biāo)記,（1）一種是在5`末端加成標(biāo)記法： 先用堿性磷酸酶（AP）去掉dsDNA 5`-磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化標(biāo)記的ATP轉(zhuǎn)移加到DNA片段5`-OH上。（2）在探針3`-末端用末端轉(zhuǎn)移酶摻入一個(gè)單標(biāo)記的ddUTP。,6.PCR 擴(kuò)增標(biāo)記,在

11、PCR擴(kuò)增時(shí)加入標(biāo)記的 dNTP ，不僅能對(duì)探針 DNA 進(jìn)行標(biāo)記還可進(jìn)行大量擴(kuò)增，尤其適合于探針 DNA 濃度很低的情形。,標(biāo)記一般流程,,核酸分子雜交,互補(bǔ)的核苷酸序列通過Walson-Crick堿基配對(duì)形成穩(wěn)定的雜合雙鏈分子DNA分子的過程稱為雜交。雜交過程是高度特異性的,可以根據(jù)所使用的探針已知序列進(jìn)行特異性的靶序列檢測(cè)。,雜交類型,Southern雜交,DNA片段經(jīng)電泳分離后,從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上,然后與探針

12、雜交。被檢對(duì)象為DNA,探針為DNA或RNA。 Southern雜交可用來檢測(cè)經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后的DNA片段中是否存在與探針同源的序列,它包括下列步驟:　　(1) 酶切DNA, 凝膠電泳分離各酶切片段,然后使DNA原位變性。 　　(2) 將DNA片段轉(zhuǎn)移到固體支持物(硝酸纖維素濾膜或尼龍膜)上。 　　(3) 預(yù)雜交濾膜,掩蓋濾膜上非特異性位點(diǎn)。 　　(4) 讓探針與同源DNA片段雜交,然后漂洗除去非特異

13、性結(jié)合的探針。 　　(5) 通過顯影檢查目的DNA所在的位置。,檢測(cè)靈敏 Southern雜交能很靈敏地檢測(cè)出低于0.1pg與32 P標(biāo)記的高比活性探針的(>109 cpm/μg)互補(bǔ)DNA。如果將10μg基因組DNA轉(zhuǎn)移到濾膜上，并與長(zhǎng)度為幾百個(gè)核苷酸的探針雜交,曝光過夜,則可檢測(cè)出哺乳動(dòng)物基因組中1kb大小的單拷貝序列。,,帶有DNA片段的凝膠,,Southern 印跡雜交的技術(shù)流程,,電泳示意圖,凝膠電泳

14、,轉(zhuǎn)印方法 (1)毛細(xì)管虹吸 優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單,不需要用其他儀器。缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)移時(shí)間較長(zhǎng),轉(zhuǎn)移后雜交信號(hào)較弱。 (2)電泳轉(zhuǎn)印 將DNA變性后,經(jīng)電泳印移至帶電荷的尼龍膜上。優(yōu)點(diǎn)是可直接轉(zhuǎn)移較大的DNA片段，缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)移中電流較大,溫度難以控制。通常只有當(dāng)毛細(xì)管和真空轉(zhuǎn)移無效時(shí),才予以采用。 (3) 真空轉(zhuǎn)移 一般是將硝酸纖維素膜或尼龍膜放在真空室上面的多孔屏上,再將凝膠置于濾膜上,緩沖液從上面的一個(gè)貯液槽中流下,洗脫出凝膠

15、中的DNA,使其沉積在濾膜上。該法的優(yōu)點(diǎn)是快速,在30分鐘內(nèi)就能從正常厚度(4-5mm)和正常瓊脂糖濃度(<1%)的凝膠中定量地轉(zhuǎn)移出來。轉(zhuǎn)移后得到的雜交信號(hào)比Southern轉(zhuǎn)移強(qiáng)2-3倍。缺點(diǎn)是如不小心，會(huì)使凝膠碎裂, 在洗膜不嚴(yán)格時(shí),其背景比毛細(xì)管法的要高。,,虹吸印跡,,分子雜交爐,雜交過程,,成像觀測(cè),放射性自顯影 利用標(biāo)記核素自身的放射性射線使感光材料感光成象的過程。目前常用的方法有: 傳統(tǒng)的膠片自顯

16、影 感光屏：醫(yī)用X光片；原理：爆光過程，射線粒子使X光片乳膠基質(zhì)中均勻分布的溴化銀晶粒感光形成物點(diǎn)的潛影，然后經(jīng)顯影及定影得像圖。膠片影象可在底片上直接觀察。,,X光自顯影暗盒及圖像增強(qiáng)屏,,成像觀測(cè),儲(chǔ)存磷光屏（storage phosphor screen） 一種由磷光晶體制成的影像屏（Imaging Plate)。經(jīng)射線爆光后IP以潛能儲(chǔ)存射線能，當(dāng)在讀取裝置下掃描讀取時(shí)， IP在掃描激光下釋放潛能發(fā)出藍(lán)綠光，光

17、強(qiáng)與爆光時(shí)射線強(qiáng)度成正比，用光電傳感器轉(zhuǎn)換電信號(hào)，再經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換成二進(jìn)制編碼信號(hào)，由計(jì)算機(jī)成象系統(tǒng)合成為影象圖。 操作：用塑料薄膜蓋電泳凝膠，貼附于裝于暗盒的磷光屏曝光，然后在成像儀上，通過掃描磷光屏上儲(chǔ)存的光能進(jìn)行成象。,,UVI化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng),與著名的Molecular DynamicsTM PhosphorImagerTM 系統(tǒng)是一樣，臺(tái)風(fēng)儲(chǔ)磷技術(shù)---磷屏Typhoon9000系列能對(duì)所有電離輻射源提供高分辨率圖像

18、并精確定量：          3H              32P          14C

19、            33P          125I           35S   

20、       18F             99mTc大成像面積，高分辯光學(xué)系統(tǒng)和靈敏的磷屏組合，為您提供可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。下圖給出的是用32P標(biāo)記的AtlasTM 微陣列(macroarray)在GP屏上的圖像。,,成像觀測(cè),閃爍光纖屏

21、 由塑料光纖制成的板，光纖中填有鉛和發(fā)光染料，使射線能轉(zhuǎn)換為可見光光子，然后再由電荷耦合器件CCD攝像機(jī)成像。較膠片和磷光屏的分辨率好，近實(shí)時(shí)成像且需曝光量低。,成像觀測(cè),放射性薄層掃描儀 由空間位置靈敏探測(cè)器組成核探測(cè)儀器?？捎糜诒訉游霭?、凝膠電泳轉(zhuǎn)印膜上放射性條帶的直接定位測(cè)定。,美國(guó)的Bioscan公司  AR-2000圖像掃描儀,AR2000圖像掃描儀可對(duì)所有類型同位素（包括3H）標(biāo)記的

22、TLC板、凝膠、印跡進(jìn)行直接定位定量計(jì)數(shù)測(cè)量。掃描儀采用充氣式計(jì)數(shù)器，可檢測(cè)γ和β射線的同位素。對(duì)整塊薄層層析條帶的掃描可在1分鐘內(nèi)完成。整套系統(tǒng)包括一個(gè)儀器控制和數(shù)據(jù)采集軟件，掃描結(jié)果以層析圖或2D圖像顯示，自動(dòng)完成對(duì)峰的定量，并以多種方式顯示結(jié)果。·應(yīng)用于TLC板、凝膠和印跡·不需破壞TLC板即可進(jìn)行定量·對(duì)所有類型同位素（包括3H）靈敏·簡(jiǎn)單易用的WinScan軟件·快

23、速、自動(dòng)、可靠的運(yùn)行·提供出色的空間分辨率·針對(duì)1、2、3塊TLC板可選擇不同的型號(hào)·2-D彩色圖像 ·主要應(yīng)用于放射化學(xué)純度、脂類生物化學(xué)、代謝研究、酶分析、毒理學(xué)研究等領(lǐng)域。,,瑞士卡瑪 產(chǎn)地：德國(guó),同位素薄層掃描儀 技術(shù)參數(shù)掃描面積為 400×200 mm（Gita , Rita ）50×200mm(mini Gita ,mini Rita

24、 ) 掃描速度：可選 軌道數(shù)目：1-80 檢測(cè)器：γ-radiation (BGO detector) ，ß-radiation (GM counting tube)，gasflow 檢測(cè)能量范圍：0-2000KeV 可檢測(cè)的放射物: γ-radiation (BGO scintillation probe) 背景: 129I:0.7 cps (20-100 KeV) 靈敏度: 129I : 20 Bq in 1

25、0 min 分辨率: 129I : 2-3 mm(depending on the used collimator) 可檢測(cè)的放射物: ß-radiation open proportional counting tube (Recommended for 3H -requires counting gas P10 = 90% Ar 10% Ch4) 背景: 18F : 0.1 cps 靈敏度: 18F : 10 Bq

26、 in 10 min 分辨率: 18F : 1-2 mm,防護(hù)措施,,,INSPECTOR,Northern雜交,Northern雜交與Southern雜交很相似,主要區(qū)別是被檢測(cè)對(duì)象為RNA,其電泳在變性條件下進(jìn)行,以去除RNA中的二級(jí)結(jié)構(gòu),保證RNA完全按分子大小分離。變性劑主要有3種:乙二醛，甲醛，羥甲基汞。電泳后的瓊脂糖凝膠用與Southern轉(zhuǎn)移相同的方法將RNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上,然后與探針雜交。,菌落原位雜交,對(duì)分散

27、在若干個(gè)瓊脂平板上的少數(shù)菌落（100-200）進(jìn)行克隆篩選時(shí)，可采用本方法。將這些菌落歸并到一個(gè)瓊脂主平板以及已置于第二個(gè)瓊脂平板表面的一張硝酸纖維素濾膜上。經(jīng)培養(yǎng)一段時(shí)間后，對(duì)菌落進(jìn)行原位裂解。主平板應(yīng)貯存于4℃直至得到篩選結(jié)果。,,菌落原位雜交,,斑點(diǎn)雜交,斑點(diǎn)雜交是指將DNA或RNA樣品直接點(diǎn)在硝酸纖維素濾膜上,然后與核酸探針分子雜交，以顯示樣品中是否存在特異的DNA或RNA。同一種樣品經(jīng)不同倍數(shù)的稀釋,還可以得到半定量的結(jié)果。所

28、以它是一種簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)的分析DNA或RNA的方法,在基因分析和基因診斷中經(jīng)常用到,是研究基因表達(dá)的有力工具。但由于目的序列未與非目的序列分離,不能了解目的序列的長(zhǎng)度。尤其當(dāng)本底干擾較高時(shí),難以區(qū)分目的序列信號(hào)和干擾信號(hào)。,,DNA序列分析,Sanger雙脫氧鏈終止法 Cambridge的F. Sanger于1977年發(fā)明。 基本原理： ①DNA聚合酶能夠以單鏈DNA作為模板，準(zhǔn)確合成的DNA互補(bǔ)鏈；②該酶能夠用2

29、9;，3'--雙脫氧核苷三磷酸作底物并將其聚合到新生寡核苷酸鏈的3'-末端，從而終止其延伸反應(yīng)。在DNA測(cè)序反應(yīng)中，加入模板DNA，引物（特異性引物，如T7，T3，M13等），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一種ddNTP。常用Klenow大片段，無5'→3'外切酶活性。,,DNA序列分析,Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法(哈佛大學(xué)) 對(duì)一個(gè)末端標(biāo)記的DNA片段，用化學(xué)試劑在A、G、

30、C、T處特定地裂解DNA片段。把反應(yīng)分為四組，每一組反應(yīng)特異性地針對(duì)某一種或某一類堿基，并且要保證每個(gè)DNA分子平均只有一個(gè)靶堿基被修飾，這樣，在每一組反應(yīng)中都在同一個(gè)或兩個(gè)核苷酸處DNA鏈發(fā)生斷裂，由于堿基位置不同，就會(huì)產(chǎn)生一組不同長(zhǎng)度的DNA片段。最后，經(jīng)過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影后就可讀出待測(cè)DNA的核苷酸序列。,化學(xué)修飾法,,Maxam-Gilbert法所用的化學(xué)修飾技術(shù),DNA序列分析,DNA序列分析自動(dòng)化

31、 用四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)作為熒光劑標(biāo)記DNA引物，帶有這種引物的DNA片段能在激光誘導(dǎo)下發(fā)出熒光。按照標(biāo)準(zhǔn)的雙脫氧終止法或化學(xué)終止法進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，跑DNA凝膠后用計(jì)算機(jī)檢測(cè)。,,熒光標(biāo)記物,,,,,,ddGTP,ddATP,ddTTP,ddCTP,,,,,,,,,,,,,單泳道電泳及信號(hào)收集,,,,,,,,,正極,負(fù)極,,,,,,,,,,計(jì)算機(jī)排序,5ˊ,GS FLX系統(tǒng)超高通量測(cè)序技

32、術(shù)原理 GS FLX系統(tǒng)的測(cè)序原理和GS 20一樣，也是一種依靠生物發(fā)光進(jìn)行DNA序列分析的新技術(shù)：在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶和雙磷酸酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個(gè)dNTP的聚合與一次熒光信號(hào)釋放偶聯(lián)起來 (圖 1)。通過檢測(cè)熒光信號(hào)釋放的有無和強(qiáng)度，就可以達(dá)到實(shí)時(shí)測(cè)定DNA序列的目的。此技術(shù)不需要熒光標(biāo)記的引物或核酸探針，也不需要進(jìn)行電泳；具有分析結(jié)果快速、準(zhǔn)確、靈敏度高和自動(dòng)化的特點(diǎn)。,GS FL

33、X系統(tǒng)的操作過程 GS FLX系統(tǒng)提供了完整的從樣品制備到后續(xù)的生物信息學(xué)分析解決方案。 1）樣品種類：GS FLX系統(tǒng)支持各種不同來源的樣品序列測(cè)定：包括基因組DNA，PCR產(chǎn)物，BAC，cDNA，小分子RNA等等。 2）樣品DNA打斷：樣品例如基因組DNA或者BAC等被打斷成300－800 bp的片段；對(duì)于小分子的非編碼RNA，這一步驟則不需要。短的PCR產(chǎn)物則可以利用GS融合引物進(jìn)行擴(kuò)增后

34、直接進(jìn)行步驟4)的工作。 3）銜接子連接：借助一系列標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)，將A和B接頭（3’和5’端具有特異性）連接到DN**段上。接頭也將在后繼的純化，擴(kuò)增和測(cè)序步驟中用到。圖中僅僅顯示了后續(xù)步驟中要用到的單鏈的DN**段。,GS FLX系統(tǒng)的操作過程 4）一條DNA片段＝一個(gè)磁珠：接頭使成百上千條DN**段結(jié)合到它們自己唯一的磁珠上，此磁珠被單個(gè)油水混合小滴包被后，在這個(gè)小滴里進(jìn)行獨(dú)立的擴(kuò)增，而沒有其他的競(jìng)爭(zhēng)性或者污

35、染性序列的影響；整個(gè)DN**段進(jìn)行平行擴(kuò)增。 5）一個(gè)磁珠＝一條讀長(zhǎng)：經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，每個(gè)磁珠上的DN**段擁有了成千上萬個(gè)相同的拷貝。經(jīng)過富集以后，這些片段仍然和磁珠結(jié)合在一起，隨后就可以放入到PicoTiterPlate板中供后繼測(cè)序使用了。 6）數(shù)據(jù)讀取和分析工具：GS FLX系統(tǒng) 在7.5小時(shí)的運(yùn)行當(dāng)中可獲得40多萬個(gè)讀長(zhǎng)，讀取超過1億個(gè)堿基信息。GS FLX 系統(tǒng)提供三種不同的生物信息學(xué)工具對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，

36、適用于不同的應(yīng)用：例如多達(dá)3 GB序列的重測(cè)序，對(duì)比已知參考序列進(jìn)行的擴(kuò)增產(chǎn)物差異分析，及 120 MB的從頭測(cè)序工作等。,,備注,焦磷酸測(cè)序(pyrosequeneing)是通過核苷酸和模板結(jié)合后釋放的焦磷酸引發(fā)酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使熒光素發(fā)光并進(jìn)行檢測(cè)的測(cè)序技術(shù)。既可進(jìn)行DNA序列分析，又可進(jìn)行基于序列分析的單核昔酸多態(tài)性(single 年nueleotide polymohism，SNP)檢測(cè)及等位基因頻率測(cè)定。 焦磷酸測(cè)序

37、是由DNA聚合酶(DNAPolymerase)、三磷酸腺酰硫酸化酶(ATPsulfurylase)、熒光素酶(luciferase)和雙磷酸酶(apyrase)4種酶催化同一反應(yīng)體系的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，反應(yīng)底物為5’---磷酰硫酸(adenosines 5’phosphosuifate，ASP）,,備注,和熒光素。反應(yīng)體系還包括待測(cè)序DNA單鏈和測(cè)序引物。在每一輪測(cè)序反應(yīng)中，加人1種dNTP，若該dNTP與模板配對(duì)，聚合酶就可以將其摻

38、人到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團(tuán)(PPi)。硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，后者驅(qū)動(dòng)熒光素酶介導(dǎo)的熒光素向氧化熒光素的轉(zhuǎn)化，發(fā)出與ATP量成正比的可見光信號(hào)，并由PyrogramMT轉(zhuǎn)化為一個(gè)峰值，其高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。根據(jù)加人dNTP類型和熒光信號(hào)強(qiáng)度就可實(shí)時(shí)記錄模板DNA的核昔酸序列。,DNA序列分析,DNA雜交測(cè)序法(SBH-Sequencing by hybridization) 如果

39、一段較短的DNA探針能與較長(zhǎng)的DNA片段雜交，并形成完全的雙鏈結(jié)構(gòu)，則可認(rèn)為靶DNA上存在著相應(yīng)的互補(bǔ)序列，這就是DNA雜交測(cè)序法的基本原理。如果將一種12-mer的靶DNA與完全隨機(jī)合成的8-mer寡核苷酸探針混合雜交，在總數(shù)為48=65536種8-mer的探針群體中，僅有5種探針會(huì)與靶DNA雜交，形成完全互補(bǔ)的雙鏈分子。,DNA雜交測(cè)序法,SBH的應(yīng)用：① 可有效檢測(cè)靶DNA中的單堿基突變；② 可用于不同DNA片段之間的序列比較

40、；③ 可用于檢測(cè)不同生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)下細(xì)胞中特定基因的表達(dá)狀況；④ 可用于檢驗(yàn)傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)的準(zhǔn)確性。,蛋白質(zhì)研究技術(shù),Western免疫印跡 將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測(cè)。 Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移

41、到固相載體（如硝酸纖維素膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。,,WB,,PCR應(yīng)用,1.PCR技術(shù)的原理 無細(xì)胞克隆法：以擬擴(kuò)增的DNA片段為模板，一對(duì)分別與模板互補(bǔ)的寡核苷

42、酸為引物，在4種脫氧核苷酸（dNTP）存在下，由DNA聚合酶在引物所結(jié)合的位置向3’方向合成新的互補(bǔ)鏈。其反應(yīng)以雙鏈DNA的變性、退火、延伸為一個(gè)循環(huán)。經(jīng)過多次循環(huán)（25-30次），便目標(biāo)DNA片段得以大量擴(kuò)增。由于每一次循環(huán)所產(chǎn)生的新鏈均可成為新的模板用于下一輪循環(huán)，故PCR產(chǎn)物以指數(shù)方式增加。,Mullis的PCR構(gòu)思,,,預(yù)變性(93-95?C,2-5m),變性(93-95?C,30s),復(fù)性(50-70?C,30s),延伸(

43、75?C,30-60s),總延伸(75?C,7m),,,,,,(25-35),PCR的一般過程：,經(jīng)過30次的循環(huán), 擴(kuò)增的DNA片段可達(dá)100萬倍以上。,PCR技術(shù)的原理,PCR步驟:（1）高溫變性，雙鏈DNA變性（90～95℃）成為單鏈；（2）低溫退火（37-60℃） ，引物與單鏈DNA互補(bǔ)序列結(jié)合；（3）適溫延伸，DNA聚合酶催化（70-75℃）使引物延伸。（4）重復(fù)（1）-（3）步。,PCR技術(shù)的原理,實(shí)驗(yàn)材料、儀器和

44、試劑 1.材料：含1Kb插入片段的克隆載體Pmd18-T 質(zhì)粒DNA 2.儀器：微量移液器及吸頭、PCR儀及PCR管 瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備 3.試劑：10XPCR反應(yīng)緩沖液 25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10μmol/L 引物1和引物2,PCR操作步驟,1.按

45、照如下體積向PCR管中按順序加入各試劑 并混勻： 10 X PCR反應(yīng)緩沖液 2.5 μL 25mmol/L MgCl2 2.0μL 10mmol/L dNTP 1.0 μL 10μmol/L 引物1 1.0 μL

46、10μmol/L引物2 1.0μL 質(zhì)粒DNA 1.0 μL Taq 0.1 μL(5U) 水補(bǔ)充至 25.0 μL,2.PCR循環(huán),,PCR儀,,3.反應(yīng)完成后,將反應(yīng)液與凝膠電泳

47、緩沖液按比例混勻,上樣電泳。,PCR操作步驟,,,,PCR應(yīng)用,,PCR應(yīng)用,2.與標(biāo)記相結(jié)合的應(yīng)用LP-PCR(labelled primers) 利用同位素、熒光素等對(duì)PCR引物進(jìn)行標(biāo)記，可用以直觀的檢測(cè)目的基因，特別適合于臨床基因診斷，同時(shí)可以檢測(cè)多種基因成分。,PCR應(yīng)用,2.與標(biāo)記相接合的應(yīng)用原位PCR (Is-PCR) 以整個(gè)細(xì)胞作為反應(yīng)體系，對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，然后通過原位雜交等不破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的方