結(jié)合18O同位素標(biāo)記和質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)的蛋白質(zhì)定量策略建立及其在肝癌生物標(biāo)志物研究中的應(yīng)用.pdf

1、生物標(biāo)志物的研究是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。采用蛋白組學(xué)的方法已經(jīng)大大加快了生物標(biāo)志物的研究進(jìn)程?；诙S凝膠電泳或生物質(zhì)譜技術(shù)的差異蛋白質(zhì)組學(xué)通過比較正常和疾病狀態(tài)下蛋白質(zhì)的表達(dá)水平變化,獲得了大量生物標(biāo)志物候選蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)必須經(jīng)過嚴(yán)格的確證和臨床驗(yàn)證才能最終成為臨床可使用的生物標(biāo)志物。而目前基于免疫原理的經(jīng)典確證方法,由于制備高特異性抗體的難度高,建立方法周期長成本高,已經(jīng)不適用于大規(guī)模的生物標(biāo)志物候選蛋白質(zhì)的確證,成為整個生物標(biāo)志

2、物研究流程中的瓶頸。基于質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)技術(shù)的SID-MRM-MS定量檢測方法,不需要抗體制備,方法建立周期短,成本低,能在同一樣品中對多個生物標(biāo)志物候選蛋白質(zhì)進(jìn)行同時測定,并且能特異性地分析翻譯后修飾蛋白質(zhì),在生物標(biāo)志物的確證環(huán)節(jié)中顯示了極大的優(yōu)越性。
　　盡管SID-MRM-MS方法已經(jīng)得到了蛋白質(zhì)組研究領(lǐng)域的廣泛認(rèn)可,但其應(yīng)用于規(guī)?；飿?biāo)志物確證所具有的低成本高通量優(yōu)越性卻由于穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)獲取困難無法展現(xiàn)。目前采

3、用的穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)制備方法在滿足大規(guī)模生物標(biāo)志物確證研究的要求上存在缺陷:以同位素標(biāo)記的氨基酸為原料制備內(nèi)標(biāo),耗時耗力,價格昂貴;采用蛋白質(zhì)重組方法合成同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo),純化復(fù)雜,化學(xué)計(jì)量值固定,不能方便地以接近真實(shí)內(nèi)源性肽段濃度的比例加入樣品進(jìn)行分析;化學(xué)衍生引入同位素標(biāo)記,在標(biāo)記內(nèi)標(biāo)的同時,還需要進(jìn)行目的蛋白酶切混合物的標(biāo)記,影響定量準(zhǔn)確性。
　　本論文研究的目的是發(fā)展方便快捷適于大規(guī)模內(nèi)標(biāo)制備的同位素引入方法,與 MRM技術(shù)結(jié)

4、合,建立普適性高通量的SID-MRM-MS定量方法,并用于臨床肝癌血清樣本中生物標(biāo)志物候選蛋白質(zhì)的確證。本論文由4個部分組成。第一章介紹了MRM質(zhì)譜檢測技術(shù)的原理及特點(diǎn),概述了基于該檢測技術(shù)的研究策略,以及該技術(shù)在翻譯后修飾、蛋白質(zhì)與RNA相互作用、生物標(biāo)志物定量驗(yàn)證中的應(yīng)用。最后結(jié)合當(dāng)前研究背景提出了本課題的研究內(nèi)容。
　　第二章闡述了基于18O穩(wěn)定同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)制備策略的建立和優(yōu)化。該研究針對目前18O標(biāo)記反應(yīng)標(biāo)記效率不穩(wěn)定

5、,標(biāo)記產(chǎn)物容易發(fā)生可逆回交的不確定因素,優(yōu)化了反應(yīng)條件,確保了反應(yīng)的可靠性,最后首次將該技術(shù)應(yīng)用于絕對定量內(nèi)標(biāo)的制備。首先加入酶切促進(jìn)劑RapigestTM SF改善肽段的分散度,改變輔助加熱方式從傳統(tǒng)的水浴加熱變?yōu)槲⒉訜醽硖岣叻磻?yīng)效率,最終在減少標(biāo)記時生物標(biāo)志物的研究是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。采用蛋白組學(xué)的方法已經(jīng)大大加快了生物標(biāo)志物的研究進(jìn)程?；诙S凝膠電泳或生物質(zhì)譜技術(shù)的差異蛋白質(zhì)組學(xué)通過比較正常和疾病狀態(tài)下蛋白質(zhì)的表達(dá)水平變化,

6、獲得了大量生物標(biāo)志物候選蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)必須經(jīng)過嚴(yán)格的確證和臨床驗(yàn)證才能最終成為臨床可使用的生物標(biāo)志物。而目前基于免疫原理的經(jīng)典確證方法,由于制備高特異性抗體的難度高,建立方法周期長成本高,已經(jīng)不適用于大規(guī)模的生物標(biāo)志物候選蛋白質(zhì)的確證,成為整個生物標(biāo)志物研究流程中的瓶頸?；谫|(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)技術(shù)的SID-MRM-MS定量檢測方法,不需要抗體制備,方法建立周期短,成本低,能在同一樣品中對多個生物標(biāo)志物候選蛋白質(zhì)進(jìn)行同時測定,并

7、且能特異性地分析翻譯后修飾蛋白質(zhì),在生物標(biāo)志物的確證環(huán)節(jié)中顯示了極大的優(yōu)越性。
　　盡管SID-MRM-MS方法已經(jīng)得到了蛋白質(zhì)組研究領(lǐng)域的廣泛認(rèn)可,但其應(yīng)用于規(guī)?；飿?biāo)志物確證所具有的低成本高通量優(yōu)越性卻由于穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)獲取困難無法展現(xiàn)。目前采用的穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)制備方法在滿足大規(guī)模生物標(biāo)志物確證研究的要求上存在缺陷:以同位素標(biāo)記的氨基酸為原料制備內(nèi)標(biāo),耗時耗力,價格昂貴;采用蛋白質(zhì)重組方法合成同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo),純化復(fù)雜,化學(xué)計(jì)

8、量值固定,不能方便地以接近真實(shí)內(nèi)源性肽段濃度的比例加入樣品進(jìn)行分析;化學(xué)衍生引入同位素標(biāo)記,在標(biāo)記內(nèi)標(biāo)的同時,還需要進(jìn)行目的蛋白酶切混合物的標(biāo)記,影響定量準(zhǔn)確性。
　　本論文研究的目的是發(fā)展方便快捷適于大規(guī)模內(nèi)標(biāo)制備的同位素引入方法,與MRM技術(shù)結(jié)合,建立普適性高通量的SID-MRM-MS定量方法,并用于臨床肝癌血清樣本中生物標(biāo)志物候選蛋白質(zhì)的確證。本論文由4個部分組成。第一章介紹了MRM質(zhì)譜檢測技術(shù)的原理及特點(diǎn),概述了基于該檢測

9、技術(shù)的研究策略,以及該技術(shù)在翻譯后修飾、蛋白質(zhì)與RNA相互作用、生物標(biāo)志物定量驗(yàn)證中的應(yīng)用。最后結(jié)合當(dāng)前研究背景提出了本課題的研究內(nèi)容。
　　第二章闡述了基于18O穩(wěn)定同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)制備策略的建立和優(yōu)化。該研究針對目前18O標(biāo)記反應(yīng)標(biāo)記效率不穩(wěn)定,標(biāo)記產(chǎn)物容易發(fā)生可逆回交的不確定因素,優(yōu)化了反應(yīng)條件,確保了反應(yīng)的可靠性,最后首次將該技術(shù)應(yīng)用于絕對定量內(nèi)標(biāo)的制備。首先加入酶切促進(jìn)劑RapigestTM SF改善肽段的分散度,改變輔

10、助加熱方式從傳統(tǒng)的水浴加熱變?yōu)槲⒉訜醽硖岣叻磻?yīng)效率,最終在減少標(biāo)記時間的同時獲得了對標(biāo)準(zhǔn)肽段100％的標(biāo)記效率;然后通過高濃度還原劑和烷基化試劑對溶液中殘留的胰酶徹底滅活,抑制了18O-16O回交反應(yīng),確保了標(biāo)記產(chǎn)物連續(xù)六天的穩(wěn)定性;最后,考察了18O標(biāo)記前后肽段進(jìn)行MRM檢測的特異性,標(biāo)記前后的肽段能互無干擾地獲得質(zhì)譜信號,保證了其用于絕對定量的可靠性。我們的研究表明,優(yōu)化后的18O標(biāo)記策略,適用于不同理化性質(zhì)肽段的標(biāo)記,能方便快速

11、、有效穩(wěn)定地標(biāo)記多肽合成內(nèi)標(biāo),滿足了絕對定量分析的需要,為規(guī)?；耐凰貎?nèi)標(biāo)制備提供了新選擇。
　　肝癌血清生物標(biāo)志物候選蛋白質(zhì)vitronectin和clusterin,在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。本實(shí)驗(yàn)室早期的研究表明兩者在血清中的表達(dá)水平變化與肝功能受損密切相關(guān)。為了方便快捷地同時確證兩個標(biāo)志物候選蛋白質(zhì)在臨床血清中的差異變化,本研究第三章闡述了結(jié)合18O同位素標(biāo)記方法,建立的基于MRM質(zhì)譜檢測技術(shù)的蛋白質(zhì)絕對定量

12、策略,并且將該策略用于中等規(guī)模的臨床血清樣品中肝癌生物標(biāo)志物vitronectin和clusterin的差異確證。首先針對血清樣品多組分高動態(tài)范圍的高度復(fù)雜性,優(yōu)化了MRM檢測條件,改善了樣品預(yù)處理過程,設(shè)計(jì)了液相色譜分離條件,滿足了多個血清樣本的高通量測定要求。然后,嚴(yán)格考察了方法絕對定量的可靠性,包括特異性、精密度、準(zhǔn)確度、預(yù)處理回收率、測定重復(fù)性以及定量線性。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示,在0.4～40 fmol/μL的濃度變化范圍內(nèi)定量測

13、定線性相關(guān)性良好,r2值大于0.99。蛋白質(zhì)最低定量限為0.4fmol/μL。精密度RSD<11.96％,準(zhǔn)確度RE％<20％。預(yù)處理回收率大于87％,測定重復(fù)性RSD<6.87％。最后,建立的方法被應(yīng)用于20例含有10例健康和10例肝癌血清的臨床樣本檢測,結(jié)果顯示兩種蛋白在肝癌血清樣品中的下調(diào)變化,展現(xiàn)了作為生物標(biāo)志物的潛在可能性。本研究創(chuàng)新性地將18O同位素標(biāo)記方法和MRM質(zhì)譜檢測技術(shù)相結(jié)合建立了方便靈活高準(zhǔn)確度、高特異性、高重現(xiàn)性

14、的蛋白質(zhì)絕對定量方法,促進(jìn)了SID-MRM-MS策略在生物標(biāo)志物確證領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用。
　　蛋白質(zhì)的核心巖藻糖化修飾與肝癌的發(fā)生發(fā)展具有更密切的相關(guān)性。但目前的研究技術(shù),由于在質(zhì)譜檢測時完全切除了糖鏈,丟失了核心巖藻糖化信息,增加了分析的假陽性結(jié)果。因此,在第四章中,我們通過簡化糖鏈,在質(zhì)譜檢測時保留部分糖基化信息,并且結(jié)合優(yōu)化的18O同位素標(biāo)記方法,首次建立了基于MRM質(zhì)譜檢測的生物標(biāo)志物核心巖藻糖化水平相對定量確證策略。本研究

15、首先對核心巖藻糖化修飾的糖鏈進(jìn)行了簡化,保留了二糖結(jié)構(gòu),在此基礎(chǔ)上對糖鏈簡化后的核心巖藻糖化糖肽進(jìn)行了三級四極桿型質(zhì)譜碎裂行為探討,為發(fā)展基于MRM的定量策略奠定基礎(chǔ);然后,結(jié)合18O同位素標(biāo)記技術(shù),發(fā)展了血清中核心巖藻糖化肽段的MRM相對定量技術(shù)策略,對18例臨床血清樣本中6個生物標(biāo)志物候選蛋白質(zhì)的7個糖基化位點(diǎn)進(jìn)行了相對糖基化水平的檢測。最后,結(jié)合總蛋白質(zhì)水平變化信息確證了核心巖藻糖化蛋白質(zhì) Alpha-2-macroglobuli