基于乙酰化穩(wěn)定同位素標記—液相色譜—傅立葉變換離子回旋共振質譜聯(lián)用的定量蛋白質組研究策略的建立、評價與應用.pdf

1、本研究目的是開發(fā)一整套具有自主知識產(chǎn)權的基于穩(wěn)定同位素標記和液質聯(lián)用的蛋白質組學定量新策略，實現(xiàn)高通量，高準確性，高靈敏度的蛋白質組學定量分析，用來克服商業(yè)化試劑存在的不足，擺脫對于商業(yè)化標記試劑的依賴性。 首先建立和優(yōu)化了一種針對肽段還原性氨基的乙?；€(wěn)定同位素標記方法。該方法經(jīng)條件優(yōu)化后具有以下優(yōu)點：乙酰化穩(wěn)定同位素試劑用量少，副反應少，能標記樣品中全部蛋白質或肽段，標記后的蛋白質或肽段的質量差可以預測，標記方法簡單，標記過

2、程反應條件溫和，標記基團在多維色譜分離條件中穩(wěn)定，標記基團在質譜分析中穩(wěn)定，不會產(chǎn)生額外的碎片離子，標記方法能夠應用于包括人體在內的所有生物樣本并且試劑廉價易得。但是單純的乙?；瘶擞浄椒擞浳稽c是還原性的氨基端，每個肽段至少標記上一個乙酰基團(即至少摻入3個氘原子)，盡管氘原子數(shù)量的增加可以避免標記肽段間同位素峰重疊問題，但是隨著摻入的氘原子數(shù)量的增加而引起的反相色譜中的同位素效應也會增加。為了減少由于同位素效應引起的標記肽段色譜保留時

3、間滯后，從而造成質譜分析的誤差，構建了基于納升級反相色譜分離、在線點靶和MAIDI-TOF/TOF-MS質譜儀聯(lián)用的定量策略。通過標準蛋白質混合物的定量實驗驗證，表明該策略完全可以實現(xiàn)準確定量分析，具有實際應用價值。在規(guī)模化蛋白質鑒定分析中，電噴霧離子源(ESI)質譜和基質輔助激光解析電離源(MAIDI)質譜相比，前者使用更為廣泛。因此，為了能夠將乙?；瘶擞浄椒ㄅc在線色譜分離和納升級電噴霧離子源的傅立葉變換離子回旋共振質譜儀聯(lián)用，同時提

4、高乙?；瘶擞浄椒ǖ馁|譜檢測靈敏度，本研究又發(fā)展了一種胍基化修飾乙?；€(wěn)定同位素標記方法。該方法除了具有上述乙?；瘶擞浄椒ǖ膬?yōu)點之外，由于胍基化修飾的乙?；臉擞浄椒ūＷC了每個肽段只會被一個乙?；鶚擞?即只有3個氘原子的摻入)，因此很好的控制了氫氘同位素試劑在反相色譜中的同位素效應，同時提高了標記肽段在質譜中的靈敏度。通過標準蛋白質混合物體系的定量分析實驗，表明該策略定量分析準確，可重復性強。 在胍基化修飾的乙?；瘶擞浄椒ń⒌?/p>

5、基礎上，根據(jù)標記方法和所使用的傅立葉變換離子回旋共振質譜儀數(shù)據(jù)采集的特點，自主開發(fā)了一套自動化數(shù)據(jù)定量分析軟件MSAQ，用于規(guī)?；亩坑嬎?。 為了進一步評價本研究中建立的基于胍基化修飾的乙?；€(wěn)定同位素標記，液相色譜一傅立葉變換離子回旋共振質譜和自主開發(fā)的定量分析軟件MSAQ聯(lián)用的定量蛋白質組策略在生物樣本中應用的可行性，將該策略在三種不同的復雜生物樣本體系中進行了實際應用，獲得了滿意的結果。 將該策略應用于大腸桿菌N

6、末端肽組學研究中。在整體蛋白質水平胍基化后的氫代氘代乙酰化標記，既提高了肽段在質譜中檢測靈敏度，又實現(xiàn)了對蛋白質N末端肽的特異性同位素標記，因而易于從一級質譜圖中識別N末端肽同時進行串聯(lián)質譜測序分析。77種大腸桿菌蛋白質的N-末端序列被確定，其中46種蛋白質N-末端序列信息和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫完全一致，另外31種蛋白質的甲硫氨酸是否去除的信息在數(shù)據(jù)庫中沒有詳細注釋，而通過我們實驗對該31種蛋白質甲硫氨酸是否去除進行了精確測定，另

7、外確證了9種蛋白質的N末端是以信號肽去除的方式存在。 實驗結果表明，本研究建立的定量蛋白質組策略不僅能對蛋白質的N末端進行規(guī)?；奶禺愋宰R別和測序，還能對N末端的翻譯后修飾(如甲酰甲硫氨酸和信號肽去除問題)進行精確測定。該策略與傳統(tǒng)的Edman降解具有靈敏度高、特異性強和通量化的優(yōu)點，因而在蛋白質N末端測序領域有著更加廣泛的應用前景。其次，將該策略應用于代謝蛋白質組學研究中。對由四氯化碳(CCl<,4>)造成的大鼠肝損傷組織CY

8、P450蛋白質表達量進行了定量研究，17種CYP450蛋白質被定量分析，其中2E1的表達量顯著下調，該結果驗證了由于2E1介導的CCl4的代謝產(chǎn)生活潑的自由基，從而導致2E1蛋白比之其他CYP450蛋白質更容易受到CCl<,4>毒理性的影響的論斷。同時除了2E1表達量顯著變化外，其他幾種CYP450蛋白質表達量同時也發(fā)生了顯著性的變化，說明本研究中所使用的規(guī)模化的定量分析手段，不僅可以對于已有研究結果進行確認，同時還可以揭示其他CYP4

9、50蛋白質表達量的變化。 最后，將該策略應用于血漿定量蛋白質組學研究。血漿蛋白質組成與細胞、組織與器官的生理病理狀態(tài)密切相關。由于血漿蛋白質含量動態(tài)范圍非常寬(>10<'12>)，因而，如果能夠對血漿蛋白質進行高通量化、高準確度和高靈敏度的定量分析，是對本研究中所建立的整套定量分析策略最好的評價。 (1)對正常血漿樣本進行了1：1標記實驗，結果顯示理論值和實驗值的誤差小于5％。 (2)對處于肝炎不同階段的血漿樣本

10、進行了定量研究，總共對1025種血漿蛋白質進行了定量分析，其中具有2倍以上顯著性差異的蛋白質有185種。包括了在血漿中濃度只有20ng/ml的Heparin cofactor 2 precursor，和濃度小于10pg/ml Angiotensinogen precursor，該結果表明本標記方法實現(xiàn)了動態(tài)范圍達9個數(shù)量級的血漿蛋白質定量分析(albumin，35mg/mL-Angiotensinogenprecursor,<10pg/

11、mL)(3)為了進一步驗證定量結果的可靠性，對其中一種差異顯著的蛋白質Fibronectin進行了western驗證。分析顯示western定量結果和質譜定量結果一致。 綜上所述，本研究建立的基于胍基化乙?；€(wěn)定同位素標記，液相色譜-傅立葉變換離子回旋共振質譜和自主開發(fā)的定量分析軟件MSAQ聯(lián)用的定量蛋白質組學新策略，既能夠對來自于原核生物的樣本進行分析，又能夠對來自真核生物的樣本進行分析，既能夠分析組織樣本又能夠分析體液樣本。