蘿卜胚發(fā)生相關(guān)基因鑒定及新型SSR標(biāo)記開發(fā).pdf

1、蘿卜（Raphanus sativus L.）是原產(chǎn)于我國的重要蔬菜作物，為十字花科蘿卜屬一、二年生草本植物。蘿卜不僅營養(yǎng)豐富，而且具有較高的藥用食療價(jià)值。蘿卜為典型的異花授粉作物，雜種優(yōu)勢十分明顯，但常規(guī)育種所需年限長，且多代自交易出現(xiàn)性狀退化等不良現(xiàn)象。單倍體具有單套染色體組，經(jīng)染色體加倍成雙單倍體后應(yīng)用于優(yōu)勢育種，可以顯著加快品種選育進(jìn)程。游離小孢子培養(yǎng)是植物單倍體育種的重要手段，但該技術(shù)在蘿卜育種中存在胚狀體誘導(dǎo)率低、成胚基因型

2、范圍狹窄、體胚發(fā)生關(guān)鍵基因尚需分離鑒定等問題仍限制了該技術(shù)在蘿卜品種改良中實(shí)際應(yīng)用;此外，蘿卜中基于編碼序列的SSR標(biāo)記開發(fā)數(shù)量還十分有限，難以為高密度遺傳圖譜及重要性狀定位分析提供高效的遺傳標(biāo)記。鑒于此，由于蘿卜小孢子體胚發(fā)生過程較難控制，基于合子胚與體細(xì)胞胚發(fā)生機(jī)制相似性，本研究選用授粉后不同時(shí)期合子胚作為研究蘿卜胚發(fā)生相關(guān)基因研究的試驗(yàn)材料，在轉(zhuǎn)錄組水平分離鑒定蘿卜胚發(fā)生過程中重要差異表達(dá)功能基因與起關(guān)鍵調(diào)控作用的miRNAs;并

3、基于NCBI數(shù)據(jù)庫中EST序列及蘿卜轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)新型SSR標(biāo)記。取得主要研究結(jié)果如下:
　　1)由于合子胚與體細(xì)胞胚發(fā)生過程較為相似，為解析蘿卜胚發(fā)生分子遺傳學(xué)特征，進(jìn)一步提高蘿卜胚發(fā)生能力，本研究采用高通量測序技術(shù)對蘿卜高代自交系‘NAU-DY13’授粉前(0 DAP)、授粉后(7_ DAP、15_ DAP)的合子胚進(jìn)行數(shù)字表達(dá)譜分析。RNA-Seq技術(shù)分別獲得7，191，808(97.31％)、7，235，080(98.25

4、％)和6，963，130(97.1％)干凈序列，對其進(jìn)行參考基因組序列比對、基因覆蓋率分析后，篩選到的的差異基因分別為分別為3，314(7_DAPvs0_DAP)個(gè)、4，268(15_DAPvs0_DAP)個(gè)及1，213（15_DAPvs7_DAP）個(gè)，其中，三文庫間一致上調(diào)基因54個(gè)，下調(diào)基因16個(gè)。GO分析表明，不同階段差異表達(dá)基因參與了細(xì)胞發(fā)育、單一器官發(fā)育、代謝過程及對刺激物的響應(yīng)等過程，并具有較好的結(jié)合能力、催化活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性

5、、核酸結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子活性等功能，主要參與主要包括淀粉與蔗糖代謝過程(ko00500)、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(ko04075)、各種氨基酸(ko00400，ko00260，ko00250)、有機(jī)物(ko00908，ko00790，ko00940)的合成代謝等127個(gè)pathway代謝途徑，其中，以參與到植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的差異基因數(shù)量最多，且部分差異表達(dá)基因如SERK、LRR、LEA、CDC及AUX1等在蘿卜胚發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。研究結(jié)

6、果為分離鑒定蘿卜胚發(fā)生關(guān)鍵基因提供理論依據(jù)。
　　2)以蘿卜高代自交系‘NAU-DY13’為材料，基于轉(zhuǎn)錄組序列與同源克隆技術(shù)成功分離蘿卜Somatic Embryogenesis Receptor-like Kinase(SERK)、Agamous like15(AGL15)、Cell Division Control2(CDC2)和Late Embryogenesis Abundant(LEA3)基因序列。研究分別獲得RsSE

7、RK1、RsAGL15、RsCDC2和RsLEA3基因的基因組DNA及cDNA序列，其開放閱讀框（ORF）分別為1905bp、818bp、882bp和285bp，編碼635、279、293和94個(gè)氨基酸。采用生物信息學(xué)方法，綜合多種在線軟件對蘿卜RsSERK1和RsAGL15蛋白的基本理化性質(zhì)、親疏水性、跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)、卷曲螺旋及二、三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析預(yù)測;采用Genome walking的方法，分離克隆到Baby Boom（RsBBM）和

8、RsCDC2基因5’上游區(qū)啟動(dòng)子序列，包含啟動(dòng)子特定結(jié)構(gòu)元件（如TATA-box，CAAT-box），還有一些激素響應(yīng)元件和種子特異調(diào)控元件等，主要參與蘿卜生長發(fā)育過程。利用qRT-PCR技術(shù)分析了蘿卜胚發(fā)生發(fā)育過程中RsSERK1、RsAGL15、RsBBM、RsCDC2和RsLEA3基因的表達(dá)特征，且RsSERK1基因主要表達(dá)于花期的花器官中，具有一定的組織表達(dá)特異性。
　　3)分別構(gòu)建了蘿卜高代自交系‘NAU-DY13’受精

9、前(0 DAP)和受精后(4-15 DAP)胚珠2個(gè)小RNA文庫，利用新一代測序(NGS)技術(shù)，分離到144個(gè)保守和34個(gè)非保守的miRNA（屬于43個(gè)已知的miRNA家族）和38個(gè)新型miRNA（屬于28個(gè)miRNA家族）。通過比較分析兩個(gè)miRNA庫，共29個(gè)已知的和10個(gè)新型的miRNA家族在蘿卜胚胎發(fā)育過程中差異表達(dá)。利用qRT-PCR技術(shù)分析驗(yàn)證了miRNA表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)某些miRNA具有組織特異性，并在不同發(fā)育時(shí)期特異表達(dá)。

10、此外，靶基因預(yù)測結(jié)果顯示，大部分靶基因?yàn)閰⑴c調(diào)節(jié)植物生長、發(fā)育和代謝的轉(zhuǎn)錄因子。值得注意的是，某些靶基因，如生長素響應(yīng)因子和agamous-like MADS-box蛋白參與了蘿卜胚胎的發(fā)育。研究結(jié)果為在分子水平闡明miRNA在植物胚胎發(fā)育調(diào)節(jié)中的作用機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。
　　4)基于NCBI數(shù)據(jù)庫的289，621條蘿卜EST序列，共選取51，625條EST序列進(jìn)行SSR位點(diǎn)的搜尋，并鑒定到2，917個(gè)SSR位點(diǎn)。這些位點(diǎn)中包含二

11、、三、四、五及六核苷酸重復(fù)序列類型，其各核苷酸重復(fù)類型的數(shù)量分別為945(32.40％)、1，300(44.57％)、179(6.14％)、262(8.98％)和231(7.92％)。其中，AG/CT(16.15％)和GA/TC(13.58％)為最豐富基元類型。共設(shè)計(jì)并合成1，082對蘿卜EST-SSR引物，其中，864(79.85％)對引物能夠得到有效擴(kuò)增。通過對48個(gè)蘿卜種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析可知，這些標(biāo)記的多態(tài)性信息含量(PIC)

12、值0.33到0.84不等，平均值為0.58。此外，隨機(jī)選取53個(gè)標(biāo)記對近緣種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)其中有25個(gè)標(biāo)記能夠得到有效的擴(kuò)增產(chǎn)物。研究結(jié)果表明，這些新型的EST-SSR標(biāo)記具有較高的多態(tài)性、可重復(fù)性，并且在近緣物種中具有較好的通用性，這為蘿卜研究工作中的分子標(biāo)記輔助選擇及遺傳圖譜的構(gòu)建提供一種及有力的研究工具。
　　5)利用蘿卜肉質(zhì)根轉(zhuǎn)錄組文庫，從73，084條unigene和150，455條contig序列中，共成功檢索到

13、位于11，311條unigene序列上的11，928個(gè)SSR位點(diǎn)。三核苷酸重復(fù)序列式最常見的重復(fù)類型，占總數(shù)的52％。同時(shí)，共開發(fā)genic-SSR標(biāo)記5，503個(gè)，從中選取1，052對引物進(jìn)行合成及驗(yàn)證，78.23％的引物對能夠產(chǎn)生穩(wěn)定條帶。選取67個(gè)標(biāo)記分析32個(gè)蘿卜品種的遺傳多樣性，其引物表現(xiàn)出的多態(tài)性信息含量值介于0.49-0.89之間。本研究采用MCID（Manual cultivar identification diagr