牡蠣皰疹病毒魁蚶株交叉引物等溫擴增檢測方法的建立及貝類派琴蟲流行病學調查.pdf

1、牡蠣皰疹病毒魁蚶株（SB strain of Ostreid herpesvirus-1，OsHV-1-SB）是由2012年6月本實驗室從山東長島、萊州、日照和即墨等地的養(yǎng)殖基地魁蚶樣品中檢測獲得，其感染健康魁蚶后，主要表現為反應遲鈍、觸碰后雙殼不閉合或閉合緩慢，外套膜內縮，內臟團呈灰白色或黑灰色。出現上述癥狀的個體一般1d內就會死亡，其死亡率可達到75％，目前關于該病毒的有效檢測方法尚未建立。本論文根據本實驗室已測序完成的OsHV-1

2、-SB全基因組序列，運用交叉引物等溫擴增（cross priming amplification，CPA）技術，通過對反應條件的優(yōu)化、CPA產物的酶切鑒定、CPA靈敏度實驗、CPA特異性實驗和實際樣品的檢測，為OsHV-1-SB建立了一種現場簡單、快速、高靈敏度的檢測方法。同時，運用聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）技術對2010年全年實驗室采集貝類樣品中派琴蟲感染情況進行了流行病學調查，以期為

3、派琴蟲的有效防控提供一定的理論依據。研究方法和部分結果如下：
　　第一部分：根據本實驗室已測序完成的OsHV-1-SB全基因組序列（文未發(fā)），選擇其保守區(qū)域作為CPA反應的靶序列，使用PrimerExplorer4.0引物設計軟件，設計出一套CPA反應引物，并對反應體系的溫度、dNTPs和Mg2+濃度和反應時間進行了優(yōu)化。結果顯示，最佳溫度為63℃，反應時間為60min，dNTPs濃度為1.4mmol/L，Mg2+濃度為6mmol

4、/L。該方法檢測靈敏度為30拷貝的質粒DNA，并且特異性較強，與貝類常見病原急性病毒性壞死病毒、鮑魚皰疹病毒、派琴蟲、包納米蟲、馬爾泰蟲以及對蝦白斑綜合征病毒和副溶血弧菌均無交叉反應。并使用實驗建立的CPA檢測方法對2012年分別采自韓國慶尚南道、山東長島、遼寧大連共計22份OsHV-1-SB感染情況未知的魁蚶樣品進行了檢測。研究表明，實驗所建立的OsHV-1-SB的CPA檢測方法簡單、快速、靈敏且特異性強。由于其檢測結果可通過簡單離心

5、觀察白色沉淀或者向反應管中加入核酸熒光染料GeneFinderTM通過顏色變化進行陰陽性判斷，所以可以在沿海條件簡陋的貝類養(yǎng)殖廠及實驗室使用，具有較好的應用前景。
　　第二部分：派琴蟲是危害貝類養(yǎng)殖業(yè)的主要寄生蟲，實驗通過對2010年全年采自山東青島、山東榮成、山東長島、廣東惠安和福建霞浦的共計548份貝類樣品，提取核酸后使用OIE推薦的PCR檢測方法對派琴蟲進行了檢測。結果顯示，全部樣品中奧爾森派琴蟲的陽性率達到了21.17%，

6、其中青島流清河貝類樣品中櫛孔扇貝（蓬萊紅和野生苗）陽性率為22.00%，貽貝陽性率為55.00%；榮成桑溝灣櫛孔扇貝（蓬萊紅、野生苗和人工苗）陽性率為16.30%，貽貝陽性率為18.52%；煙臺長島縣貝類樣品陽性率較低，只有皺紋盤鮑檢測到陽性，櫛孔扇貝野生苗和蝦夷扇貝中均沒有檢測到奧爾森派琴蟲。同時，對各月份采集貝類樣品奧爾森派琴蟲的整體陽性比率進行匯總分析，結果顯示，奧爾森派琴蟲感染主要發(fā)生在夏季水溫較高季節(jié)，其中在7月達到了峰值。而

7、在1、2、12月水溫較低時期，未檢測到奧爾森派琴蟲感染陽性樣品。
　　第三部分：急性病毒性壞死病毒（AVNV）是阻礙櫛孔扇貝養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要病原，本文根據已完成的AVNV全基因組序列，通過PCR技術得到編碼AVNV多重跨膜蛋白的ORF110基因，并進行了TA克隆得到pMD18-T-110質粒，經限制性內切酶SnaBⅠ和NotⅠ雙酶切后和真核表達載體pPIC9K連接、轉化到大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞，構建得到用于蛋白表達的重組質粒