重癥急性胰腺炎大鼠肝損傷中NF-κB和Foxp3的表達(dá)及連翹對(duì)其影響.pdf

1、重癥急性胰腺炎（severeacutepancreatitis，SAP）作為常見的重癥疾病，病死率非常高，死亡主要的原因是細(xì)胞因子（如TNF-α）的激活、免疫功能的紊亂以及炎癥介質(zhì)的釋放。因血流動(dòng)力學(xué)和解剖的關(guān)系，肝臟成為SAP最早累及的胰外器官之一，其并發(fā)肝損傷的機(jī)率可高達(dá)88.9％[1]，其機(jī)制主要是失控性炎癥反應(yīng)及機(jī)體免疫功能紊亂。而NF-κB在上述病變的發(fā)生過(guò)程中起著"信使"作用。作為重要的轉(zhuǎn)錄因子,NF-κB參與免疫反應(yīng)和淋巴

2、細(xì)胞分化,其活化可能調(diào)控著SAP的啟動(dòng)。NF-κB信號(hào)通路對(duì)Foxp3表達(dá)的調(diào)控起著非常關(guān)鍵的作用，當(dāng)NF-κB被激活或信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)時(shí)可直接促進(jìn)Foxp3的表達(dá)和Treg細(xì)胞的增加，從而分泌大量的抑制性細(xì)胞因子來(lái)調(diào)節(jié)免疫功能的紊亂。SAP肝損傷重要的發(fā)病機(jī)制之一為腸源性內(nèi)毒素血癥，祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為內(nèi)毒素血癥在病機(jī)上為邪實(shí)正虛，所以治療應(yīng)是祛邪與扶正的有機(jī)結(jié)合[2]。連翹具有抗內(nèi)毒素、抗炎，又有其顯著的增強(qiáng)機(jī)體免疫和解毒系統(tǒng)對(duì)內(nèi)毒素予以解毒的

3、功效[3]。且目前尚未見在SAP肝損傷中應(yīng)用的報(bào)告。本實(shí)驗(yàn)擬探討核因子(NF)-κB和Foxp3在重癥急性胰腺炎（SAP）肝損傷中的作用機(jī)制及連翹對(duì)其表達(dá)活性和SAP肝損傷保護(hù)的影響。
　　第一章重癥急性胰腺炎大鼠肝損傷中NF-κB和Treg的表達(dá)
　　研究目的：探討核因子(NF)-κB和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）在重癥急性胰腺炎（SAP）肝損傷中的作用及其可能的機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法：雄性Wistar大

4、鼠48只，隨機(jī)分成假手術(shù)組（SO組）（n=24）和模型組（SAP組）（n=24）。SO組僅翻動(dòng)胰腺，不注射牛黃膽酸鈉（NaTc），SAP組逆行性胰膽管注射?；悄懰徕c溶液（0.1ml/100g），SO組和SAP組均于術(shù)后3h、6h、12h在麻醉下處死大鼠，無(wú)菌操作法分別留取腹主動(dòng)脈血、胰腺、肝臟的標(biāo)本待測(cè)。生化儀測(cè)各組血淀粉酶（AMY）及谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）水平，放射免疫法測(cè)血漿腫瘤壞死因子（TNF-α），鱟試劑法測(cè)血漿內(nèi)毒素含量，流式細(xì)

5、胞術(shù)測(cè)外周血Treg百分?jǐn)?shù)，對(duì)胰腺及肝臟進(jìn)行病理學(xué)檢查及評(píng)分，RT-PCR法檢測(cè)肝臟組織中NF-κBmRNA和Foxp3mRNA表達(dá)量,并對(duì)上述所有指標(biāo)統(tǒng)計(jì)后進(jìn)行分析。
　　主要結(jié)果：與SO組比較，SAP組中各項(xiàng)指標(biāo)均隨時(shí)間升高，并于12h達(dá)高峰，外周血中的Treg百分?jǐn)?shù)與血漿中的AMY、ALT及TNF-α的含量均隨時(shí)間明顯升高，SAP組的肝臟、胰腺有明顯的病理性改變，各時(shí)間點(diǎn)胰腺、肝臟病理學(xué)評(píng)分均顯著高于SO組（P<0.01）。

6、此外肝臟組織NF-κBmRNA的增高導(dǎo)致了Foxp3mRNA和外周血Treg表達(dá)明顯升高，呈時(shí)間依賴性和動(dòng)態(tài)性，（p<0.01），NF-κBmRNA的表達(dá)與Treg呈正相關(guān)（r=0.738，p<0.01）。
　　主要結(jié)論：SAP可引起肝損傷，NF-κB高水平激活和Treg大量增多參與SAP肝損傷的發(fā)生。
　　第二章連翹對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠肝損傷中NF-κB和Foxp3表達(dá)的影響
　　研究目的：研究各個(gè)濃度的連翹水煎液對(duì)

7、SAP大鼠肝損傷12h后的肝臟組織中NF-κB和Foxp3水平表達(dá)的影響，探討在用連翹干預(yù)后對(duì)SAP肝損傷大鼠中的NF-κB作用及免疫調(diào)節(jié)作用以及兩者之間的可能機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法：雄性Wistar大鼠48只，隨機(jī)分成假手術(shù)組（SO組）（n=8）、SAP組（n=8）和干預(yù)組（n=32），其中干預(yù)組分連翹高（AFS1組）、中（AFS2組）、低（AFS3組）劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組(PDTC組)。連翹干預(yù)組在造摸前7天開始給藥，給予連翹水煎

8、液H（5g/kg）、M（2.5g/kg）、L（1.25g/kg），每天一次，選用灌胃方式。陽(yáng)性對(duì)照組于造摸前1小時(shí)給藥，100mg/Kg，腹腔注射。每組的模型制作及在12小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)上留取的標(biāo)本均同第一章。測(cè)各組血淀粉酶（AMY）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）及TNF-α水平，鱟試劑法測(cè)血漿內(nèi)毒素含量，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)外周血Treg百分?jǐn)?shù)，對(duì)胰腺及肝臟進(jìn)行病理學(xué)檢查及評(píng)分，RT-PCR法檢測(cè)肝臟組織中NF-κBmRNA和Foxp3mRNA表達(dá)量，并

9、對(duì)上述所有指標(biāo)統(tǒng)計(jì)后進(jìn)行分析。
　　主要結(jié)果：與SO組比較，SAP組外周血中的Treg百分?jǐn)?shù)與血漿中的AMY、ALT及TNF-α的含量均于12h時(shí)明顯升高，且肝臟、胰腺有明顯的病理性改變，同時(shí)胰腺、肝臟病理學(xué)評(píng)分均顯著高于SO組（P<0.01）。干預(yù)組（大鼠死亡率為0）肝臟組織中的上述指標(biāo)明顯下降，NF-κBmRNA和Foxp3mRNA表達(dá)的降低與Treg呈正相關(guān)（r=0.738，p<0.01）。隨連翹劑量增加，AMY、ALT及T

10、NF-α的含量均明顯降低，肝臟和胰腺組織炎癥明顯減輕，高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組相比較無(wú)明顯差異（p>0.05）。
　　結(jié)論
　　1.采用5%牛磺膽酸鈉造模后，病理學(xué)檢測(cè)證實(shí)：胰腺和肝臟組織中出現(xiàn)了不同程度的壞死、水腫、出血及炎細(xì)胞浸潤(rùn)，說(shuō)明大鼠重癥急性胰腺炎造模成功。
　　2.隨SAP的發(fā)展，肝功能及病理?yè)p害進(jìn)行性加重，證實(shí)SAP時(shí)出現(xiàn)了肝功能的障礙和肝損傷。
　　3.SAP的進(jìn)行性發(fā)展可引起肝損傷，肝臟組織中NF-

11、κB、Foxp3的含量及外周血中Treg百分率升高，NF-κB高水平激活和Treg大量增多參與SAP肝損傷的發(fā)生。
　　4.SAP時(shí)，應(yīng)用連翹能顯著降低NF-κB的活性及肝臟組織中NF-κBmRNA和Foxp3mRNA的表達(dá)，減輕SAP肝損傷的嚴(yán)重程度。連翹通過(guò)抗炎、抗內(nèi)毒素作用及其顯著的增強(qiáng)機(jī)體免疫的功能對(duì)SAP大鼠的肝損傷起著重要的治療作用。
　　上述研究了NF-κB和Foxp3在重癥急性胰腺炎所致肝損傷中的作用機(jī)理及連