TLR-2和MMP-2在胎膜早破患者胎盤和胎膜組織中的表達(dá)及其意義.pdf

1、胎膜早破(Premature Rupture of Membrane，PROM)是指臨產(chǎn)前發(fā)生的胎膜破裂，可以給孕產(chǎn)婦和新生兒的健康造成嚴(yán)重影響，可引發(fā)感染、胎盤早剝、產(chǎn)后出血、早產(chǎn)、臍帶受壓等多種危及母兒健康和生命的疾病。妊娠期發(fā)生胎膜早破的因素很多，但其最基本的病理變化是炎癥和胎膜本身結(jié)構(gòu)的缺陷。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要從胎膜結(jié)構(gòu)的變化、機(jī)械外力、感染因素、免疫等方面研究胎膜早破發(fā)生的原因，并且取得了極大的進(jìn)展。感染一直是學(xué)者們公認(rèn)的與

2、胎膜早破發(fā)生最為密切的相關(guān)因素之一。臨床上有部分孕婦在出現(xiàn)破膜前后處于亞臨床感染狀態(tài)，無(wú)明顯的表現(xiàn)。因此早期診斷合并有感染的胎膜早破尤為重要。其中細(xì)菌感染、支原體和衣原體感染是導(dǎo)致生殖道炎癥的常見因素。Toll樣受體(Toll like receports，TLRs)是參與體內(nèi)的固有免疫的一類古老的蛋白質(zhì)家族。TLRs在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要的作用，是激活相關(guān)細(xì)胞分泌炎性介質(zhì)的閘門受體，其中TLR-2是TLRs家族中表達(dá)范圍最廣、識(shí)別病

3、原微生物及其產(chǎn)物種類最多的分子之一。病理研究結(jié)果亦證實(shí)早破胎膜的特征為胎膜中細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)蛋白質(zhì)表達(dá)的低水平。基質(zhì)金屬蛋白(matrix metalloproteinases，MMPs)幾乎能降解ECM的所有成分，其中MMP-2在整個(gè)妊娠期持續(xù)表達(dá)。但PROM的具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前尚無(wú)理想的防治辦法。本文旨在通過(guò)研究TLR-2和MMP-2在胎膜早破患者和正常妊娠晚期胎盤和胎膜組織

4、中的表達(dá)情況及兩者之間的關(guān)系來(lái)進(jìn)一步揭示其發(fā)病機(jī)制，可能為預(yù)防與治療PROM提供研究方向。
　　目的:
　　本文旨在通過(guò)研究TLR-2mRNA，MMP-2mRNA及其蛋白在足月胎膜早破組和正常晚孕組胎膜組織中的表達(dá)是否存在差異，免疫組化法定位TLR-2和MMP-2在兩組孕婦的胎盤和胎膜組織中的位置，探討兩者在胎膜早破發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用及其關(guān)系。
　　材料和方法:
　　1.研究對(duì)象
　　隨機(jī)選取2012年

5、9月-2013年1月因胎膜早破在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院住院并且以剖宮產(chǎn)術(shù)結(jié)束妊娠的足月胎膜早破孕婦30例作為實(shí)驗(yàn)組(PROM組)，胎膜早破的診斷依據(jù)樂(lè)杰主編的第七版《婦產(chǎn)科學(xué)》教材。隨機(jī)抽取同期以剖宮產(chǎn)術(shù)結(jié)束妊娠的正常晚期、胎膜完整的妊娠婦女30例，作為對(duì)照組。兩組病例所有孕婦均無(wú)其他母體疾病或者產(chǎn)科并發(fā)癥。兩組孕婦均為初產(chǎn)、單活胎，剖宮產(chǎn)指征為孕婦的骨盆狹窄或者孕婦要求等。
　　2.方法
　　兩組孕婦均知情同意。所有標(biāo)本的采

6、集均在胎盤娩出后20min內(nèi)進(jìn)行，選擇臍帶附著處的母體面胎盤組織，垂直剪切2塊組織(大小約2cm×2cm×2cm)，避開梗死、鈣化灶、出血等異常位置;剪切胎膜早破患者破口周圍胎膜2塊(大小約2cm×2cm)。將獲得的組織以0.9％氯化鈉溶液漂洗干凈，無(wú)菌濾紙去除組織上的血液，1塊組織保存于10％甲醛溶液中用于石蠟包埋切片，另外1塊置于無(wú)菌凍存管-80℃保存，用于提取mRNA。光學(xué)顯微鏡下行病理學(xué)檢查用于診斷絨毛膜羊膜炎。采用Real-t

7、imePCR法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組孕婦胎膜組織中TLR-2mRNA和MMP-2mRNA的表達(dá)。采用免疫組化法(SP法)檢測(cè)30例足月胎膜早破和30例正常組胎盤胎膜組織中TLR-2和MMP-2蛋白的定位與表達(dá)。
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)上的分析。計(jì)量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);多組間比較采用單因素方差分析進(jìn)行，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法

8、(LSD-t法)。兩變量的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。選擇α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　結(jié)果:
　　1.PROM組和對(duì)照組孕婦一般臨床數(shù)據(jù)情況的比較
　　PROM組和對(duì)照組孕婦相比，PROM組年齡在23-35歲之間，平均年齡25.341±5.484歲;孕周在37-41周之間，平均孕周38.516±2.124周。同期正常的妊娠婦女作為對(duì)照組，年齡在23-35歲之間，平均年齡25.841±3.334歲，孕周在37-4

9、1周之間，平均孕周38.433±1.764周。孕時(shí)BMI分別為29.023±3.841，29.534±3.681，兩組孕婦的年齡、孕時(shí)BMI、孕周比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.PROM組與正常對(duì)照組晚孕期胎膜組織中TLR-2mRNA，MMP-2mRNA的表達(dá)
　　兩組孕產(chǎn)婦胎膜組織中均可檢測(cè)到TLR-2mRNA，MMP-2mRNA的表達(dá)，PROM組TLR-2mRNA，MMP-2mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.5

10、81±0.142，0.616±0.164，正常對(duì)照組分別為0.353±0.191，0.348±0.123;胎膜組織中實(shí)驗(yàn)組TLR-2mRNA、MMP-2mRNA的表達(dá)水平均較對(duì)照組明顯升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。
　　3.PROM組與正常對(duì)照組晚孕期胎盤胎膜組織中的TLR-2與MMP-2蛋白的定位表達(dá)
　　附圖2為胎盤胎膜組織陰性對(duì)照和HE染色結(jié)果，陰性對(duì)照:免疫組化過(guò)程中用PBS代替一抗得到的結(jié)果;免疫組化

11、結(jié)果顯示:TLR-2和MMP-2蛋白在PROM組及正常對(duì)照組胎盤胎膜組織中均有表達(dá)，在PROM組胎盤胎膜組織中的染色強(qiáng)度明顯高于正常對(duì)照組，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。
　　在PROM組胎盤組織中TLR-2主要表達(dá)于合體滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，MMP-2主要表達(dá)于合體滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色顆粒沉著;另外在胎盤絨毛和蛻膜間質(zhì)中也偶有TLR-2表達(dá)，MMP-2在胎盤絨毛血管內(nèi)皮細(xì)胞以及間質(zhì)細(xì)胞里少量表達(dá)，TL

12、R-2和MMP-2在PROM組胎膜組織表達(dá)于羊膜上皮細(xì)胞和絨毛膜的細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞，TLR-2、MMP-2的表達(dá)定位在實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組基本相同，但實(shí)驗(yàn)組大多細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可明顯見到棕染的顆粒。應(yīng)用病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)定TLR-2與MMP-2的平均光密度值，測(cè)定結(jié)果如下:PROM組胎盤組織中TLR-2與MMP-2的平均光密度值分別為0.141±0.011和0.186±0.015，正常足月組TLR-2與MMP-2的平均光密度值分別為0.083±0.

13、004和0.118±0.007，PROM組和正常足月組相比差異有顯著性(均P＜0.001)。胎膜組織中PROM組TLR-2與MMP-2的平均光密度值比較分別為0.318±0.007，0.486±0.015，正常足月組TLR-2與MMP-2的平均光密度值分別為0.283±0.0040.341±0.011，PROM組和正常足月組差異有顯著性（均P＜0.001）。胎膜組織中的TLR-2與MMP-2蛋白表達(dá)量的相關(guān)性:在正常妊娠組二者不存在相關(guān)

14、，足月胎膜早破組中存在顯著正相關(guān)。(r=0.166，P＞0.05;r=0.434，P＜0.05)
　　4.絨毛膜羊膜炎患者胎膜組織中的TLR-2與MMP-2蛋白的水平變化
　　胎膜病理檢查結(jié)果顯示:兩組孕婦發(fā)生絨毛膜羊膜炎的共15例，其中胎膜早破組絨毛膜羊膜炎13例，感染率為21％;對(duì)照組絨毛膜羊膜炎2例，感染率為3.3％。絨毛膜羊膜炎患者胎膜中TLR-2和MMP-2的水平明顯高于非絨毛膜羊膜炎患者，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

15、(P＜0.001及P＜0.001)。
　　5.PROM組不同Apgar評(píng)分新生兒的胎膜組織中TLR-2與MMP-2蛋白的水平
　　胎膜早破組Apgar評(píng)分≤7分新生兒的胎膜組織中TLR-2和MMP-2的水平顯著高于Apgar評(píng)分≥8分的新生兒，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001及P＜0.001)。
　　6.PROM組不同破膜時(shí)間的患者胎膜組織中的TLR-2與MMP-2蛋白的水平變化
　　隨破膜時(shí)間的延長(zhǎng)PR