鱟抗內(nèi)毒素因子模擬肽設(shè)計合成及生物活性研究.pdf

1、膿毒癥(sepsis)和膿毒性休克是導致危重病患者死亡的主要原因之一，據(jù)統(tǒng)計，全球每年因膿毒癥死亡的病人高達100萬以上，病死率高達40-60％。 內(nèi)毒素(Lipopolysaccharide，LPS)是引起膿毒癥的主要啟動子。LPS通過血漿LPS結(jié)合蛋白(LBP)轉(zhuǎn)運，與單核/巨噬細胞膜上的受體CD14結(jié)合，形成LPS-CD14復合物后再與跨膜受體TLRs結(jié)合，將外源信號轉(zhuǎn)入胞內(nèi)，導致單核/巨噬細胞活化，釋放TNF-α、IL-

2、6等細胞因子，介導膿毒癥的發(fā)生。在膿毒癥患者中，LPS的檢出率、檢出水平均與病情及預后密切相關(guān)。因此，封閉LPS的活性是從源頭上防治內(nèi)毒素血癥的關(guān)鍵。 國內(nèi)外針對內(nèi)毒素血癥的防治策略目前主要有抑制LPS的合成、阻斷LPS與其受體的結(jié)合、阻斷LPS的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導、抗細胞因子療法、糖皮質(zhì)激素治療等措施，但均收效甚微。多粘菌素B(PMB)雖能有效中和LPS，但其嚴重的毒副作用又限制了其臨床應用。其他抗菌抗LPS蛋白，如殺菌性/通透性增

3、加蛋白、鱟抗內(nèi)毒素因子及其衍化多肽和一些天然抗菌抗內(nèi)毒素肽的研究大多處于實驗階段，至今仍無有效低毒的藥物應用于臨床，因此研制高親和力、能中和細菌LPS，同時兼有殺菌活性的藥物是當今世界醫(yī)學領(lǐng)域研究的重點。 如何能從源頭上封閉LPS的生物活性、阻止和切斷其所致一系列炎癥性“瀑布”反應呢?據(jù)文獻報道，美洲鱟和東方鱟的鱟抗內(nèi)毒素因子(LALF及TALF)在體外和動物體內(nèi)具有顯著的抗G-桿菌及中和LPS活性。LALF高親和性地以劑量依賴

4、方式結(jié)合LPS并封閉其生物學活性，對膿毒癥小鼠模型具有顯著保護作用，能有效延長其生命，降低死亡率，抑制LPS誘導的TNFα分泌，避免臟器損傷。進一步采用LALF的抗菌抗LPS活性功能區(qū)即第31-52氨基酸殘基序列的研究發(fā)現(xiàn)，不論是預防性或是治療性給予LALF31-52，均可顯著保護暴發(fā)性腹膜膿毒癥模型小鼠，改善全身性的TNFa反應，減少器官損害，增加生存率。迄今的研究還證實，TALF41-53是結(jié)合LPS的最小序列，TALF29-59具

5、有與LPS結(jié)合最大潛能。 前人的研究成果為我們進一步的研究奠定了堅實基礎(chǔ)，為了能便捷獲得大量有效中和LPS的藥物前體，我們應用生物信息學分析LALF、TALF及其功能區(qū)的結(jié)構(gòu)特性，應用計算機分子模擬技術(shù)，設(shè)計并合成了一系列鱟抗內(nèi)毒素因子模擬肽，經(jīng)固相化學合成和一系列體內(nèi)外實驗研究，獲得了兩條具有較理想中和LPS及抗菌活性的鱟抗內(nèi)毒素因子模擬肽RREMP和TYS1。 研究主要結(jié)果和結(jié)論：1.通過在線使用PHD和GOR方法，

6、結(jié)合Antheprot5.0和APD對鱟抗內(nèi)毒素因子及其功能區(qū)位點結(jié)構(gòu)進行分析，準確獲得了其分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、分子動力學的各項參數(shù)，如形成α螺旋、擴展鏈、隨機卷曲的部位、構(gòu)成這些結(jié)構(gòu)的殘基數(shù)和比例，陽性和陰性電荷的數(shù)目和空間分布狀況，分子的親疏水曲線、分子量、等電點、結(jié)合能等，為分子模擬設(shè)計提供豐富而準確的信息。 2.通過計算機模擬設(shè)計，經(jīng)適當變構(gòu)、修飾，成功獲得15條鱟抗內(nèi)毒素因子模擬肽序列。 3.通過固相多肽合成法

7、，采用多肽合成儀自動合成和手工合成相結(jié)合，成功合成了16條/種鱟抗內(nèi)毒素因子模擬肽和對照肽。 4.通過鱟試驗、生物傳感器親和力試驗、細胞因子刺激試驗、細胞毒性試驗、體外抗菌試驗及小鼠體內(nèi)LPS中和試驗和保護試驗等多種實驗手段，在16條/種模擬肽中成功篩選出RREMP和TYS1兩條具有較好的體內(nèi)外LPS中和活性和抗菌活性的模擬肽RREMP和TYS1。 5.RREMP和TYS1在體內(nèi)外均能有效抑制由LPS介導的TNF-α的釋

8、放。對致死量LPS攻擊小鼠具有顯著保護作用，避免或減輕了小鼠器官組織結(jié)構(gòu)的損傷。5μM濃度保護下，小鼠7日生存率均為60％，生存時間明顯延長。 6.RREMP和TYS1在體內(nèi)穩(wěn)定性好，LPS中和率高于同類文獻報道，極具希望成為理想的中和LPS藥物前體。 7.S4和S1兩條肽經(jīng)過轉(zhuǎn)鹽處理后活性發(fā)生了意想不到的根本改變，如醋酸鹽使原本具有良好體外中和LPS活性的S4喪失了活性，但卻使其拓寬了抗菌譜，增強了抗菌能力。相反，醋酸

9、鹽卻使原本不具LPS中和活性的S1呈現(xiàn)出了顯著的體內(nèi)外LPS中和活性及抗菌活性。說明不同的鹽類對多肽的活性影響較大。 研究主要的創(chuàng)新點：1.研究在沒有大型計算機和昂貴的商用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析軟件的情況下，應用個人計算機利用免費蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析軟件和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析網(wǎng)絡(luò)服務器，成功設(shè)計并合成得到了全新的15條鱟抗內(nèi)毒素因子模擬肽序列，節(jié)省了大量實驗經(jīng)費。 2.通過對15條模擬肽的體內(nèi)外研究，得到了具有較強抗菌/抗內(nèi)毒素活性的S4、

10、RREMP和TYS1三條肽，其序列為自主設(shè)計，具有完全的知識產(chǎn)權(quán)。 3.RREMP和TYS1中和LPS活性穩(wěn)定，能有效抑制由LPS介導的TNF-α的釋放，對致死量LPS攻擊小鼠具有顯著保護作用，同時還具有抗G-菌和G+菌活性。作用與天然鱟抗內(nèi)毒素因子的功能區(qū)位點LALF31-52相當或更強，具有潛在的藥用開發(fā)價值。 4.本研究對S4、S1轉(zhuǎn)鹽后的活性研究顯示，在合成肽的轉(zhuǎn)鹽過程中，不同的鹽類可使多肽活性產(chǎn)生根本性改變，是