類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎特異性預(yù)警檢測方法建立.pdf

1、目的：抗環(huán)瓜氨酸肽（cyclic citrullinated peptide，CCP）抗體由類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）患者B細胞分泌，對RA早期診斷具有特異性，同時對預(yù)測骨損傷程度及RA臨床預(yù)后評估有重要價值。本研究擬建立一種檢測人血清中抗CCP抗體含量的膠體金定量檢測方法，為該病的預(yù)警診斷及預(yù)后評估提供一種技術(shù)手段，以此來推動該疾病特異性檢測方法的進步。
　　方法：
　　1.通過人工合

2、成技術(shù)合成CCP多肽，經(jīng)碳二亞胺偶聯(lián)技術(shù)使CCP多肽與牛血清白蛋白（BSA）偶聯(lián)，優(yōu)化最佳偶聯(lián)條件，對偶聯(lián)產(chǎn)物應(yīng)用紫外（UV）法、SDS-PAGE進行鑒定、利用間接酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）進行生物活性檢測，確定最適CCP多肽偶聯(lián)物。
　　2.研制用于定量檢測血清中抗CCP抗體含量的膠體金試紙條。通過對膠體金顆粒、標(biāo)記pH優(yōu)化、標(biāo)記最低抗體量優(yōu)化、免疫金保護液pH值優(yōu)化、試紙條材料的選擇與處理、最佳包被量的確定等方面研究，對試紙

3、條性能從線性范圍、精密性、穩(wěn)定性、回收率及臨床樣本的檢測等方面進行評價。初步建立人血清抗CCP抗體膠體金定量檢測方法。
　　結(jié)果：
　　1.確定CCP-BSA偶聯(lián)12h為最佳偶聯(lián)用時，獲得可與抗CCP抗體特異結(jié)合的CCP-BSA偶聯(lián)物，經(jīng)檢測鑒定確定偶聯(lián)成功、產(chǎn)物有效，可用于制備膠體金試紙條。
　　2.本研究建立的間接膠體金定量檢測方法的工藝技術(shù)條件為：氯金酸與檸檬酸三鈉體積比1：1.5制備的膠體金效果最佳；膠體金溶液

4、保存最佳條件為加入0.05％的疊氮鈉；標(biāo)記時1mL膠體金溶液加入3μL0.2mol/mL K2CO3，最低標(biāo)記抗體量為8.8μg；免疫金保護液最佳pH為8.8；質(zhì)控線包被羊抗鼠IgG最佳濃度為1.0mg/mL；檢測線包被CCP-BSA偶聯(lián)抗原最佳濃度為1.5mg/mL；包被緩沖液中蔗糖含量0.4%；金墊鋪金量為400μL/10cm，金標(biāo)定量儀讀數(shù)時間為試劑反應(yīng)后14min。
　　3.建立的膠體金定量檢測方法性能指標(biāo)為：線性范圍50

5、～500RU/mL，R2=0.993，精密性質(zhì)控品L1批內(nèi)CV=2.6%，批間CV=4.52%；精密性質(zhì)控品L2批內(nèi)CV=2.5%，批間CV=4.28%，高值、中值、低值血清的回收率分別為100.96%、97.17%、91.46%，用40份臨床樣本與國外試劑盒平行測試，結(jié)果表明兩者具有相關(guān)性，回歸方程：Y=1.004X+7.968，R2=0.955。
　　結(jié)論：
　　1.利用碳化二亞胺偶聯(lián)技術(shù)成功將CCP多肽與BSA大分子偶