體外受精—胚胎移植中影響子宮內(nèi)膜異位癥患者妊娠結(jié)局的相關(guān)因素分析及GDF-9在子宮內(nèi)膜異位癥患者卵泡液和顆粒細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMs)是指子宮內(nèi)膜組織（腺體和間質(zhì)）出現(xiàn)在子宮腔以外的任何部位而引起的一種疾病，為育齡婦女常見病、多發(fā)病，是引起女性不孕的常見原因之一。體外受精-胚胎移植(in vitrofertilization-embryo transfer，IVF-ET)技術(shù)的應(yīng)用成為解決不孕癥的有效方法，但與其他因素不孕行IVF-ET治療的患者相比，子宮內(nèi)膜異位癥較差的妊娠結(jié)局給患者帶來很大的精神壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。子

2、宮內(nèi)膜異位癥導(dǎo)致IVF-ET不良結(jié)局的因素紛繁復(fù)雜，包括生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)、卵子質(zhì)量、胚胎發(fā)育、胚胎植入及內(nèi)膜容受性改變等方面。目前很多研究已經(jīng)從上述層面分析了子宮內(nèi)膜異位癥與IVF-ET妊娠結(jié)局的關(guān)系，而其中卵母細(xì)胞質(zhì)量下降是影響其治療結(jié)局的關(guān)鍵因素之一。
　　卵母細(xì)胞的質(zhì)量體現(xiàn)了卵子內(nèi)在的發(fā)育潛能，質(zhì)優(yōu)的卵母細(xì)胞在正常受精、胚胎發(fā)育及著床的過程中起到至關(guān)重要的作用，并且對妊娠的建立和維持、胎兒的發(fā)育也具有深刻影響，因此在IVF

3、-ET中努力提高卵母細(xì)胞質(zhì)量意義重大。卵母細(xì)胞的發(fā)育包括生長和成熟兩個階段，其成熟與卵泡的生長相伴進(jìn)行。同時，卵母細(xì)胞通過廣泛的縫隙連接，局部因子的自分泌及旁分泌功能與周圍的顆粒細(xì)胞進(jìn)行信息交流，構(gòu)成統(tǒng)一的整體。因此，從卵泡液的成分及顆粒細(xì)胞方面對卵母細(xì)胞質(zhì)量進(jìn)行研究評估引起廣泛關(guān)注，而卵母細(xì)胞分泌因子（Oocyte secreted factors，OSFs）的發(fā)現(xiàn)又為研究卵母細(xì)胞質(zhì)量、預(yù)測胚胎質(zhì)量及妊娠結(jié)局提供了新的思路。在眾多卵母

4、細(xì)胞因子中，生長分化因子-9(growth differentiation factors，GDF-9)是最早被發(fā)現(xiàn)對卵泡發(fā)育具有重要作用，并且有研究發(fā)現(xiàn)，以正常婦女作對照，嚴(yán)重子宮內(nèi)膜異位癥婦女經(jīng)腹腔鏡穿刺大卵泡的卵泡液中，GDF-9水平下降明顯。
　　綜上所述，本研究第一部分通過回顧因子宮內(nèi)膜異位癥因素行IVF助孕患者的臨床及實(shí)驗(yàn)室資料并與單純因輸卵管因素不孕者進(jìn)行比較，探討影響子宮內(nèi)膜異位癥IVF-ET結(jié)局的相關(guān)因素;第二部

5、分通過測定子宮內(nèi)膜異位癥患者血清、卵泡液中GDF-9水平及黃素化顆粒細(xì)胞上GDF-9的蛋白及mRNA的表達(dá)，探討GDF-9與子宮內(nèi)膜異位癥的關(guān)系，力圖探索其影響卵母細(xì)胞質(zhì)量的可能途徑，以期為指導(dǎo)臨床治療提供理論依據(jù)及新思路。
　　第一部分、體外受精-胚胎移植中影響子宮內(nèi)膜異位癥患者妊娠結(jié)局的相關(guān)因素分析
　　目的:回顧性分析因子宮內(nèi)膜異位癥行體外受精-胚胎移植助孕患者的臨床及實(shí)驗(yàn)室資料，并與單純因輸卵管因素者進(jìn)行比較，探討影

6、響子宮內(nèi)膜異位癥IVF-ET結(jié)局的相關(guān)臨床和實(shí)驗(yàn)室因素。
　　方法:對河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科2011年1月至2013年3月行常規(guī)IVF周期的患者，根據(jù)病因不同將子宮內(nèi)膜異位癥組作為實(shí)驗(yàn)組（A組）、單純因輸卵管因素不孕者為對照組（B組）;其中又根據(jù)妊娠結(jié)局將A組分為妊娠組（A1組）、非妊娠組(A2組)。A組共129個周期，移植周期為114例，其中A1組60例，A2組54例;B組共1660個周期。①比較A、B兩組患者的一般資料

7、如年齡，不孕年限，體重指數(shù)(BMI)，血清基礎(chǔ)卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)水平，原發(fā)不孕與繼發(fā)不孕比例;②比較A、B兩組促排卵方案的構(gòu)成比，促性腺激素(Gn)使用天數(shù)及用藥量，人絨毛膜促性腺激素(HCG)注射日（以下簡稱HCG日）血清LH、E2、孕酮(P)水平;③比較A、B兩組平均獲卵數(shù)、受精率、正常受精率、卵裂率、可移植胚胎數(shù)、移植胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、周期冷凍率，全胚冷凍率;④比較A、B兩組胚胎種植率及臨床

8、妊娠率、多胎率及流產(chǎn)率。⑤比較A1、A2兩組患者年齡、不孕年限、原發(fā)和繼發(fā)不孕比例、基礎(chǔ)性激素水平、使用Gn天數(shù)及用量、HCG日LH、E2、P水平以及各種方案構(gòu)成比;⑥比較A1、A2兩組平均獲卵數(shù)、受精率、正常受精率、卵裂率、可移植胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、周期冷凍率等。
　　結(jié)果:1789個IVF周期中，子宮內(nèi)膜異位癥組共129個周期（A組），對照組1660個周期（B組）。①A、B兩組患者的平均年齡分別為31.29±4.31歲、29.

9、21±4.04歲，A組顯著高于B組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-5.275，P＜0.05);A、B兩組患者的不孕年限分別為4.57±3.99年、3.80±2.73年，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.064，P＜0.05);A、B兩組患者原發(fā)不孕的比例分別為62.80％、52.53％，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=5.035，P＜0.05);A、B兩組血清基礎(chǔ)FSH、LH水平分別為8.18±3.12mIU、3.95±1.79mI

10、U和7.88±3.73mIU、4.74±3.22mIU，兩組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-1.145，P＞0.05; Z=1.176，P＞0.05）;A、B兩組血清基礎(chǔ)E2水平為57.47±53.01pg/ml、44.92±32.32pg/ml，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-3.011，P＜0.05);②A、B兩組患者促排卵方案（長方案、短方案、拮抗劑方案、超長方案）的構(gòu)成比分別為26.3％、4.7％、10.9％、58.1％和78.4

11、％、5.2％、12.9％、3.4％，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=529.442，P＜0.05）;A、B兩組的Gn天數(shù)與Gn用量分別為10.78±2.25天、2896.90±824.71IU和10.13±2.12天、2375.85±764.96IU,兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-3.610，P＜0.05，Z=-7.548，P＜0.05);A、B兩組患者的HCG日血清LH、E2、P水平分別為1.69±1.77mIU/ml、2543.

12、88±1547.71 pg/ml、1.04±0.56ng/ml和2.23±2.54mIU/ml、3407.31±1444.48pg/ml、1.17±0.69ng/ml，兩組比較LH、E2及P水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=5.715，P＜0.05; Z=6.16，P＜0.05; Z=2.430，P＜0.05);③A、B兩組患者的平均獲卵數(shù)分別為9.69±7.17枚、13.67±7.83枚，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=6.508，P＜0.0

13、5);A、B兩組患者的受精率和正常受精率分別為73.60％、60.08％和84.32％、63.54％，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=100.131，P＜0.05; x2=6.130，P＜0.05);A、B兩組患者的卵裂率分別為98.91％、98.90％，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=3.617，P＞0.05);A、B兩組患者的優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)分別為2.39±3.32個、3.86±3.91個，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=4.712，P＜

14、0.05);A、B兩組患者的可利用胚胎數(shù)分別為4.01±3.82個、5.94±4.27個，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=5.740，P＜0.05);A、B兩組移植胚胎數(shù)分別為2.00±0.51個、1.70±0.89個，兩組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Z=0.634，P＞0.05）;A、B兩組挽救ICSI(rescue ICSI，R-ICSI)率分別為2.29％、2.97％，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=0.324，P＞0.05）;④A、B兩組患

15、者的周期冷凍率分別為44.96％、64.76％，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=20.203，P＜0.05)，但兩組的全胚冷凍率分別為10.08％、16.20％，比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=3.216，P＞0.05);A、B兩組胚胎種植率及臨床妊娠率分別為35.65％、52.63％和36.69％、53.89％，A組低于B組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=0.068，P＞0.05; x2=0.099，P＞0.05）;A、B兩組的多胎率分別為

16、33.33％、30.11％，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.280，P＞0.05);A、B兩組的流產(chǎn)率分別為11.67％、6.80％，A組高于B組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=2.044，P＞0.05）。⑤A1、A2兩組平均年齡、不孕年限分別為30.33±3.72歲、3.93±2.74年和32.33±4.72歲、5.18±5.26年，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=1.766，P＞0.05;Z=0.935，P＞0.05);A1、A2兩組

17、患者的原發(fā)不孕率為71.67％、33.33％，A1組顯著高于A2組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=16.788，P＜0.05);A1、A2兩組血清基礎(chǔ)FSH、E2水平分別為8.31±3.30mIU、59.46±62.22pg/ml和8.74±3.27mIU、55.15±51.52pg/ml，兩組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=1.086，P＞0.05;Z=-0.738，P＞0.05);兩組基礎(chǔ)LH水平為3.55±1.75mIU、4.31±

18、1.91 mIU，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.082，P＜0.05);A1、A2兩組平均使用Gn天數(shù)分別為10.17±3.84天、10.29±2.54天，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-0.609，P＞0.05）;A1、A2兩組平均Gn用藥量分別為2699±676.91IU、3132.1±923.58IU，A1組少于A2組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-2.758，P＜0.05）;A1、A2兩組HCG日E2水平為2691.9

19、0±1415.73pg/ml、2191.22±1513.05pg/ml，A1組顯著高于A2組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.018，P＜0.05)。⑥A1、A2兩組的平均獲卵數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、可移植胚胎數(shù)分別為9.50±5.18枚、2.68±2.90個、4.30±3.00個和7.72±5.14枚、1.38±1.83個、2.81±2.12個，A1組均高于A2組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.364，P＜0.05; Z=-2.40

20、1，P＜0.05;Z=-3.023，P＜0.05);A1、A2兩組受精率、正常受精率分別為74.56％、61.75％和74.10％、58.03％，A1組雖均高于A2組，但兩組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.027，P＞0.05; x2=1.391，P＞0.05);A1、A2兩組卵裂率為98.82％、98.06％，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.710，P＞0.05);兩組周期冷凍率為53.33％、24.07％，A1組顯著高于A2組，

21、兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=10.184，P＜0.05)。
　　結(jié)論:子宮內(nèi)膜異位癥患者年齡偏大，不孕年限長，原發(fā)不孕比例高，在卵巢刺激中對促排卵藥物反應(yīng)性差以及卵母細(xì)胞的受精異常，這些因素可能導(dǎo)致了臨床妊娠率、種植率偏低，流產(chǎn)率偏高;子宮內(nèi)膜異位癥中臨床妊娠者具有對促排卵藥物反應(yīng)性好、胚胎質(zhì)量優(yōu)的特點(diǎn)。
　　第二部分、GDF-9在子宮內(nèi)膜異位癥患者卵泡液和顆粒細(xì)胞中的表達(dá)
　　目的:通過測定GDF-9在子宮內(nèi)膜異

22、位癥患者卵巢刺激中血清、卵泡液中的水平及黃素化顆粒細(xì)胞上GDF-9蛋白及其mRNA的表達(dá)，探討GDF-9與子宮內(nèi)膜異位癥患者卵母細(xì)胞質(zhì)量和IVF妊娠結(jié)局的關(guān)系，尋找其影響卵母細(xì)胞質(zhì)量的可能途徑。
　　方法:收集于2012年8月至2013年3月在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科行體外受精-胚胎移植的子宮內(nèi)膜異位癥患者30例（A組）的血清、卵泡液及黃素化顆粒細(xì)胞，同時以同期單純因輸卵管不孕患者30例（B組），作為對照組。比較兩組一般指標(biāo)

23、如年齡、基礎(chǔ)性激素水平(FSH、LH、E2)、Gn天數(shù)及用量、平均獲卵數(shù)、平均受精率、平均正常受精率、平均卵裂率、可移植胚胎數(shù)（率）、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)（率）、胚胎種植率及臨床妊娠率等;用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測定兩組血清、卵泡液中GDF-9水平;蛋白印記法測定兩組黃素化顆粒細(xì)胞中GDF-9蛋白表達(dá);逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscriptase-polym

24、erase chain reaction, RT-PCR)測定顆粒細(xì)胞上GDF-9mRNA表達(dá);比較兩組血清、卵泡液中GDF-9水平、黃素化顆粒細(xì)胞中GDF-9蛋白及mRNA的表達(dá);分析血清、卵泡液GDF-9水平、黃素化顆粒細(xì)胞中GFDF-9蛋白及mRNA表達(dá)與年齡、Gn天數(shù)及用量、獲卵數(shù)、可移植胚胎數(shù)（率）、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)（率）、受精率、卵裂率等的相關(guān)性。
　　結(jié)果:子宮內(nèi)膜異位癥組共30個周期（A組），對照組30個周期（B組）。①

25、A、B兩組女方的平均年齡分別為31.50±4.83歲、28.15±4.27歲，A組顯著高于B組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-3.080，P＜0.05); A、B兩組血清基礎(chǔ)FSH、LH、E2水平分別為8.31±3.62mIU、4.30±1.78mIU、58.88±49.27pg/ml和7.34±1.69mIU、4.42±1.76 mIU、43.72±36.81pg/ml，兩組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-0.412，P＞0.05;t

26、=-0.249，P＞0.05;Z=-1.224，P＞0.05）;②A、B兩組的Gn天數(shù)與Gn用量分別為11.17±1.42天、3010.83±655.19IU和9.55±1.28天、2184.20±580.00IU，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-4.080，P＜0.05;Z=-4.699，P＜0.05);A、B兩組患者的HCG日LH、E2水平分別為1.38±1.20mIU/ml、3066.37±1612.51pg/ml和2.02±1

27、.26mIU/ml、3846.06±1216.97pg/ml，A組均低于B組，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=3.142，P＜0.05; Z=2.016，P＜0.05);但A、B兩組患者的HCG日P水平分別為1.18±0.47ng/ml、1.14±0.69ng/ml，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=0.606，P＞0.05）;③A、B兩組患者的平均獲卵數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、可移植胚胎數(shù)分別為10.63±8.10枚、3.27±4.82個、4.47

28、±4.90個和15.15±8.23枚、5.28±5.12個、7.03±5.46個，A組均低于B組，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Z=-2.792，P＜0.05; Z=-2.295，P＜0.05; Z=-2.380，P＜0.05);A、B兩組平均受精率為81.63％±15.72％、77.84％±17.52％，兩組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-0.700，P＞0.05);A、B兩組平均正常受精率分別為55.93％±22.05％、67.34％±15.

29、67％，A組低于B組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-2.331，P＜0.05）;A、B兩組患者的平均卵裂率分別為97.46％±9.74％、97.67％±5.73％，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.351，P＞0.05); A、B兩組移植胚胎數(shù)分別為1.73±0.94個、1.76±0.79個，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=0.142，P＞0.05）;④A、B兩組的周期冷凍率分別為40％、66.66％，A組顯著低于B組，兩組比較差異有

30、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=20.203，P＜0.05)，但兩組的全胚冷凍率分別為13.33％、15.15％，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=0.042，P＞0.05）;A、B兩組胚胎種植率分別為30.77％、34.48％，臨床妊娠率分別為53.33％、60.60％，多胎率分別為60％和66.67％，流產(chǎn)率分別為20.00％、8.33％，兩組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=0.172，P＞0.05; x2=0.063，P＞0.05; x2=0.10

31、5，P＞0.05; x2=0.630,P＞0.05）;⑤A、B兩組取卵日的血清、卵泡液中GDF-9的水平分別為153.47±9.81pg/ml、143.00±90.28pg/ml和204.40±137.65pg/ml、236.85±163.40 pg/ml，A組均明顯低于B組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=2.047，P＜0.05; Z=2.216，P＜0.05);A、B兩組黃素化顆粒細(xì)胞中GDF-9蛋白及mRNA表達(dá)分別為0.53±0

32、.17、0.57±0.21和0.72±0.19、0.75±0.18，A組均明顯低于B組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=3.615，P＜0.05;t=-3.699，P＜0.05);⑥A組黃素化顆粒細(xì)胞中GDF-9蛋白與與獲卵數(shù)、可移植胚數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)呈正相關(guān)(r=0.703，P＜0.05; r=0.644，P＜0.05;r=0.665，P＜0.05);A組黃素化顆粒細(xì)胞上mRNA表達(dá)與與獲卵數(shù)、可移植胚數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)呈正相關(guān)(r-=0，5

33、15，P＜0.05; r=0.569，P＜0.05; r=0.526，P＜0.05);B組黃素化顆粒細(xì)胞上GDF-9蛋白及mRNA與受精率呈正相關(guān)，(r=0.442，P＜0.05; r=0.430，P＜0.05)。⑦A1、A2組血清、卵泡液中GDF-9濃度分別為191.63±102.04pg/m、196.43±116.83pg/m和134.35±95.45pg/m、124.5699.70pg/m，A1組顯著高于A2組，兩組比較差異均有統(tǒng)

34、計(jì)學(xué)意義(Z=-2.288，P＜0.05; Z=-2.332，P＜0.05); A1、A2組黃素化顆粒細(xì)胞上GDF-9蛋白及mRNA表達(dá)水平分別為0.63±0.15、0.70±0.17和0.48±0.16、0.50±0.20，A1組均高于A2組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.485，P＜0.05; Z=-2.772，P＜0.05); B1、B2兩組血清、卵泡液中GDF-9濃度分別為256.52±157.45 pg/ml、279.24

35、±129.78 pg/ml和172.89±119.48 pg/ml、190.43±169.01 pg/ml，B1組顯著高于B2組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.156，P＜0.05; Z=-2.090，P＜0.05);B1、B2兩組顆粒細(xì)胞上GDF-9蛋白及GDF-9mRNA水平分別為0.70±0.22、0.68±0.22和0.70±0.17、0.78±0.14，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.210，P＞0.05;t=-1.