電針激活α7nAchR介導(dǎo)的膽堿能抗炎通路在膿毒癥中發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、膿毒癥是ICU（Intensive Care Unit）住院患者首要致死原因，雖然對(duì)膿毒癥治療的探索已取得一些進(jìn)展，但是由于整體免疫調(diào)節(jié)治療手段的缺乏，其死亡率仍居高不下。高死亡率主要與膿毒癥引起的難控制性的全身炎癥反應(yīng)，并最終發(fā)展成多臟器功能衰竭相關(guān)。因此，積極開發(fā)經(jīng)濟(jì)高效的治療手段及措施，早期切斷炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，降低膿毒癥死亡率，有著巨大的理論和臨床意義。
　　近年，我科及國(guó)內(nèi)外同行發(fā)現(xiàn)，電針在膿毒癥治療及腦缺血損傷防護(hù)

2、方面有可靠療效，其機(jī)制可能與膽堿能抗炎通路的激活密切相關(guān)，但是具體機(jī)制不清。膽堿能抗炎通路是近10年來(lái)對(duì)迷走神經(jīng)功能研究的一項(xiàng)新的成果，自發(fā)現(xiàn)以來(lái)一直是深入研究的主題。該途徑通過(guò)與巨噬細(xì)胞上α7煙堿型乙酰膽堿受體的相互作用來(lái)控制炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)機(jī)體自主神經(jīng)系統(tǒng)控制系統(tǒng)免疫，展現(xiàn)出其臨床應(yīng)用于治療膿毒癥類過(guò)度免疫炎癥反應(yīng)性疾病方面的巨大潛力。
　　因此，本實(shí)驗(yàn)旨在探索電針是否通過(guò)激活巨噬細(xì)胞上α7nAChR介導(dǎo)的膽堿能抗炎通路，從而對(duì)

3、膿毒癥小鼠發(fā)揮器官保護(hù)和抗炎以及減小死亡率的作用，為臨床ICU患者預(yù)防膿毒癥的發(fā)生提供理論支持,且為開發(fā)新的治療手段提供依據(jù)。
　　第一部分：電針激活α7nAchR介導(dǎo)的膽堿能抗炎通路在膿毒癥小鼠中發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究
　　實(shí)驗(yàn)一：觀察電針對(duì)于膿毒癥小鼠器官功能和全身炎癥反應(yīng)的影響
　　目的：觀察電針對(duì)于CLP誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠器官功能和全身炎癥反應(yīng)的影響
　　方法：雄性C57BL/6小鼠24只，隨機(jī)分為4組：假

4、手術(shù)Sham組（n=6）、CLP組（n=6）、電針EA+CLP組（n=6）和假電針EA-sham+CLP組（n=6）。其中EA+CLP組于造模前5天開始電針，選擇穴位為雙側(cè)足三里穴，刺激強(qiáng)度為1mA，2Hz疏密波，每日一次，每次30min，持續(xù)5天，假電針組只扎穴位不電刺激。盲腸結(jié)扎與穿孔（CLP）24h后取小鼠左肺下葉做病理組織切片，取小鼠右肺葉稱其濕重與干重，并計(jì)算濕干重比；對(duì)小鼠進(jìn)行支氣管肺泡灌洗后BCA蛋白定量法檢測(cè)灌洗液中蛋白

5、濃度，取小鼠右肝下葉做CD68標(biāo)記的巨噬細(xì)胞和Ly-6G標(biāo)記的嗜中性粒細(xì)胞的免疫組化染色，對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔灌洗后用ELISA法檢測(cè)灌洗液中促炎因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：在CLP24h后，與Sham組相比，小鼠肺組織出現(xiàn)病理?yè)p傷，肺濕干重比增大，氣管肺泡灌洗蛋白濃度增高（P＜0.05），肝臟巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增加，腹腔灌洗液中TNF-α和IL-1β顯著增高（P＜0.05），而電針改善了肺組織病理?yè)p傷

6、程度，減小了肺濕干重比值，降低了支氣管肺泡灌洗蛋白濃度，減輕了肝臟炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)和降低了腹腔灌洗液中促炎因子的水平（P＜0.05）。
　　結(jié)論：電針可以減輕膿毒癥小鼠臟器損傷和全身炎癥反應(yīng)。
　　實(shí)驗(yàn)二：驗(yàn)證電針是否通過(guò)激活膽堿能抗炎通路對(duì)膿毒癥小鼠發(fā)揮保護(hù)作用
　　目的：探索電針是否通過(guò)激活膽堿能抗炎通路減輕膿毒癥小鼠器官損傷和全身炎癥反應(yīng)。
　　方法：雄性C57BL/6小鼠130只，隨機(jī)分為5組：假手術(shù)Sha

7、m組（n=26）、CLP組（n=26）、電針EA+CLP組（n=26），α7nAchR抑制劑MLA+EA+CLP組（n=26）和α7nAchR激動(dòng)劑GTS-21+CLP組（n=26）。盲腸結(jié)扎與穿孔（CLP）24h后，每組20只小鼠觀察術(shù)后7天生存率，其余取材，取材部位以及檢測(cè)指標(biāo)同實(shí)驗(yàn)一。
　　結(jié)果：在CLP24h后，與Sham組相比，小鼠生存率明顯降低（P＜0.05），肺組織出現(xiàn)病理?yè)p傷（P＜0.05），肝臟巨噬細(xì)胞和嗜中性粒

8、細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增加，腹腔灌洗液中TNF-α和IL-1β顯著增高（P＜0.05），而電針改善了小鼠的各項(xiàng)異常指標(biāo)。與EA+CLP組相比，MLA逆轉(zhuǎn)了電針對(duì)膿毒癥小鼠生存率的提高，逆轉(zhuǎn)了肺組織病理?yè)p傷的減輕，逆轉(zhuǎn)了電針對(duì)膿毒癥小鼠肝臟巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的減輕，阻斷了電針對(duì)膿毒癥小鼠的腹腔灌洗液促炎因子水平的降低，而GTS-21均模擬了電針的各項(xiàng)保護(hù)效應(yīng)（P＜0.05）。
　　結(jié)論：電針對(duì)膿毒癥小鼠發(fā)揮保護(hù)作用可能是通過(guò)激活α7n

9、AchR介導(dǎo)的膽堿能抗炎通路實(shí)現(xiàn)的。
　　實(shí)驗(yàn)三：電針激活α7nAchR介導(dǎo)的膽堿能抗炎通路對(duì)膿毒癥小鼠NF-κB的影響
　　目的：研究電針激活α7nAchR介導(dǎo)的膽堿能抗炎通路后對(duì)膿毒癥小鼠肺臟中NF-κB的影響以及藥物激活該通路對(duì)LPS誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞中NF-κB的影響。
　　方法：
　　1.探索電針激活α7nAchR介導(dǎo)的膽堿能抗炎通路后對(duì)膿毒癥小鼠肺臟中NF-κB的影響：
　　雄性C57BL/6小

10、鼠21只，隨機(jī)分為4組：Sham組（n=6）、CLP組（n=6）、EA+CLP組（n=6），MLA+EA+CLP組（n=3）。其中，MLA腹腔注射30min后進(jìn)行電針，同樣持續(xù)5天。CLP24h后取小鼠左肺下葉用Western blot技術(shù)檢測(cè)各分組中小鼠的左肺下葉中NF-κB的表達(dá)水平。
　　2.藥物激活膽堿能抗炎通路對(duì)LPS誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞中NF-κB的影響：從雄性C57BL/6小鼠體內(nèi)提取腹腔巨噬細(xì)胞，體外培養(yǎng)于24孔板，

11、隨機(jī)分為3組：對(duì)照組、LPS組、LPS+GTS-21組，各組藥物刺激24h后，免疫熒光染色觀察NF-κB p65在細(xì)胞內(nèi)的位置。
　　結(jié)果：
　　1.膿毒癥小鼠左肺下葉中NF-κB的表達(dá)相比于Sham組顯著增高（P＜0.05），而.電針明顯下調(diào)了NF-κB的表達(dá)（P＜0.05）。MLA阻斷膽堿能抗炎通路后再電針處理，相比于電針組，MLA又部分恢復(fù)了膿毒癥小鼠肺臟NF-κB的表達(dá)水平，表明MLA阻斷了電針的保護(hù)作用。
　

12、　2.與對(duì)照組腹腔巨噬細(xì)胞相比，LPS組NF-κB p65從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，而GTS-21干預(yù)后反轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象。
　　結(jié)論：電針激活α7nAchR介導(dǎo)的膽堿能通路可能是通過(guò)降低膿毒癥小鼠NF-κB的活性發(fā)揮作用且α7nAchR激動(dòng)劑逆轉(zhuǎn)了LPS誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位。
　　第二部分：藥物激活α7nAchR介導(dǎo)的膽堿能抗炎通路在LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中發(fā)揮抗炎效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究
　　實(shí)驗(yàn)一：LPS對(duì)巨

13、噬細(xì)胞促炎因子分泌的量效和時(shí)程關(guān)系的影響
　　目的：觀察不同濃度和同一濃度LPS對(duì)巨噬細(xì)胞促炎因子分泌的量效和時(shí)程關(guān)系的影響。
　　方法：
　　1.觀察LPS對(duì)巨噬細(xì)胞促炎因子分泌的量效關(guān)系RAW264.7細(xì)胞，隨機(jī)分為6組：對(duì)照組、1μg/L LPS、10μg/L LPS、100μg/L LPS、500μg/L LPS和1000μg/L LPS組，刺激5h后，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液TNF-α的水平;
　

14、　2.觀察LPS對(duì)巨噬細(xì)胞促炎因子分泌的時(shí)程關(guān)系RAW264.7細(xì)胞，隨機(jī)分為8組，均接受100ng/ml LPS刺激，時(shí)間點(diǎn)包括即刻、2h、4h，8h、12h、24h、48h、72h， ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液TNF-α的水平。
　　結(jié)果： LPS組TNF-α的表達(dá)較對(duì)照組升高，且在100ng/ml LPS組TNF-α的表達(dá)較對(duì)照組升高達(dá)高峰（P＜0.001）；24h組在100ng/ml LPS刺激后TNF-α的表達(dá)較對(duì)照

15、組升高達(dá)高峰（P＜0.001）。
　　結(jié)論： LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞促炎因子TNF-α表達(dá)上調(diào)，在24h達(dá)高峰
　　實(shí)驗(yàn)二：α7nAchR激動(dòng)劑激活膽堿能抗炎通路后對(duì)巨噬細(xì)胞促炎因子分泌的影響
　　目的：觀察α7nAchR激動(dòng)劑GTS-21對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞促炎因子TNF-α、IL-1β、HMGB1分泌的影響
　　方法：
　　1.用免疫熒光法檢測(cè)α7nAchR這一膽堿能抗炎通路的關(guān)鍵受體是否存在

16、于RAW264.7巨噬細(xì)胞膜上；
　　2. a.實(shí)驗(yàn)分為5組：對(duì)照組、1μM GTS-21、10μM GTS-21、100μM GTS-21和1000μM GTS-21組，藥物刺激24h后，CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力；b.實(shí)驗(yàn)分為5組：對(duì)照組，LPS組，LPS+1μM GTS-21、LPS+10μM GTS-21、LPS+100μM GTS-21組，藥物刺激24h后，CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力；
　　3.實(shí)驗(yàn)分為4組：對(duì)照組、LPS

17、、LPS+10μM GTS-21、LPS+100μM GTS-21組，藥物刺激24h后，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液TNF-α、IL-1β的水平
　　4.實(shí)驗(yàn)分為3組，對(duì)照組、LPS組、LPS+100μM GTS-21組，藥物刺激24h后Western blot檢測(cè)HMGB1的表達(dá)水平，免疫熒光定位HMGB1在細(xì)胞內(nèi)的位置。
　　結(jié)果：α7nAchR存在于RAW264.7巨噬細(xì)胞膜上，α7nAchR激動(dòng)劑GTS-21無(wú)細(xì)胞

18、毒性作用且GTS-21劑量依賴性地恢復(fù)了LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞活力下降（P＜0.05），GTS-21劑量依賴性地降低了LPS誘導(dǎo)的促炎因子TNF-α、IL-1β表達(dá)水平（P＜0.05），同時(shí)降低了LPS誘導(dǎo)的HMGB1的表達(dá)水平（P＜0.05）,并反轉(zhuǎn)了LPS誘導(dǎo)的HMGB1胞質(zhì)轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)論：α7nAchR激動(dòng)劑劑量依賴性地降低了LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞促炎因子TNF-α、IL-1β、HMGB1的分泌水平。
　　實(shí)驗(yàn)三：α7nAc

19、hR激動(dòng)劑對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中NF-κB的影響
　　目的：觀察α7nAchR激動(dòng)劑對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中NF-κB狀態(tài)的影響
　　方法： RAW264.7細(xì)胞，隨機(jī)分為3組：對(duì)照組、LPS組、LPS+100μM GTS-21組,藥物刺激24h后免疫熒光染色觀察NF-κB p65在細(xì)胞內(nèi)的位置。
　　結(jié)果：與對(duì)照組相比，LPS組NF-κB p65從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，而GTS-21組反轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象。
　　結(jié)論