SEVI淀粉樣纖維結(jié)構(gòu)形成的影響因素及抑制劑的研究.pdf

1、本課題擬進(jìn)行以下兩部分內(nèi)容的探討:
　　第一部分衍生于HIV-1 gp120的多肽促進(jìn)SEVI淀粉樣纖維形成的作用及機(jī)制研究。
　　目的:
　　擬采用一系列生物物理及生物化學(xué)手段，深入探討這些衍生于HIV包膜蛋白gp120的衍生多肽EP2與SEVI及SEM1(86-107)的淀粉樣纖維形成的相互作用和作用機(jī)制，分析EP2促進(jìn)SEVI及SEM1(86-107)形成從而增強(qiáng)病毒感染的機(jī)理。同時(shí)研究短肽INMWQG（簡稱為S

2、EMA）能否增強(qiáng)HIV感染及促進(jìn)SEVI，SEM1(86-107)淀粉樣纖維的形成，該研究為臨床殺微生物劑和抗HIV藥物研發(fā)提供理論依據(jù)。
　　方法與結(jié)果：
　　采用Zetasizer Nano ZS儀器測(cè)定EP2的粒徑和Zeta電勢(shì)，ThT熒光測(cè)定方法，透射電鏡法，我們發(fā)現(xiàn)來源于HIV gp120的衍生多肽EP2能自組裝形成類納米纖維。透射電鏡法，硫磺素T熒光檢測(cè)方法，剛果紅染色法，圓二色譜法，我們確定EP2顯著促進(jìn)PAP

3、248-286多肽形成SEVI淀粉樣纖維，經(jīng)EP2加速形成的SEVI保持其淀粉樣纖維形態(tài)。用激光共聚焦顯微鏡法和流式細(xì)胞術(shù)，確定EP2加速后形成的SEVI能促進(jìn)HIV-1病毒顆粒聚集并增強(qiáng)其與靶細(xì)胞的結(jié)合。采用假病毒和克隆病毒感染實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí)了經(jīng)EP2加速形成的SEVI保持其增強(qiáng)HIV感染的能力。
　　類似研究EP2加速SEVI形成方法，采用Zetasizer Nano ZS儀器測(cè)定SEMA的粒徑和Zeta電勢(shì)，ThT熒光測(cè)定方

4、法，透射電鏡法，我們發(fā)現(xiàn)SEMA能自組裝形成淀粉樣纖維，通過克隆病毒感染實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)，確定SEMA增強(qiáng)HIV-1感染能力。激光共聚焦顯微鏡法直觀觀察了SEMA促進(jìn)HIV-1病毒顆粒聚集或增強(qiáng)HIV病毒顆粒與靶細(xì)胞的結(jié)合。
　　接著，我們考察SEMA是否加速SEVI或SEM1(86-107)淀粉樣纖維形成的能力。通過硫磺素T熒光檢測(cè)方法，剛果紅染色法，我們發(fā)現(xiàn)SEMA顯著促進(jìn)PAP248-286或SEM1(86-107)多肽形成

5、淀粉樣纖維，同時(shí)用克隆病毒感染實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了經(jīng)SEMA加速形成的SEVI或SEM1(86-107)淀粉樣纖維保持其增強(qiáng)HIV感染的能力。
　　結(jié)論：
　　1.來自HIV-1 gp120包膜EP2能自組裝成納米纖維并促進(jìn)精液源性淀粉樣纖維如SEVI的形成;2.正常HIV-1病毒包膜蛋白gp120攻擊大鼠肝細(xì)胞后，其肝細(xì)胞裂解液中能檢測(cè)出的gp120的裂解片段(INMWQG)，能增強(qiáng)HIV-1感染，并促進(jìn)精液源性淀粉樣纖維如SEV

6、I，SEM1(86-107)的形成。
　　第二部分酸酐修飾的兔抗SEVI多克隆抗體IgG(HP-API)作為雙功能殺微生物劑研究。
　　目的：
　　我們的前期研究證明，兔抗SEVI多克隆抗體能特異性地與SEVI多肽結(jié)合，從而產(chǎn)生拮抗SEVI增強(qiáng)病毒感染的作用，但其自身抗HIV病毒活性不強(qiáng)。酸酐修飾蛋白可以使不具有抗HIV活性的OVA變成高抗HIV活性的蛋白分子HP-OVA及ML-OVA。為此，本項(xiàng)目擬以SEVI為藥物作

7、用靶點(diǎn)，采用酸酐修飾方法制備酸酐修飾抗SEVI多抗，研發(fā)一種既具有高效抗HIV活性又具有拮抗SEVI病毒增強(qiáng)作用的雙功能候選殺微生物劑。進(jìn)一步采用一系列生物物理及生物化學(xué)手段，深入探討該酸酐修飾抗SEVI抗體與精液及SEVI多肽PAP248-286的相互作用，以評(píng)價(jià)其是否能通過與SEVI多肽特異性地結(jié)合而拮抗SEVI增強(qiáng)HIV感染的作用，從而最大程度地避免未來臨床試驗(yàn)失敗的可能性。同時(shí)，深入分析酸酐修飾抗SEVI抗體阻止SEVI增強(qiáng)HI

8、V感染的可能的機(jī)制和可能的引起毒性反應(yīng)，為后續(xù)的藥物研發(fā)提供理論依據(jù)。
　　方法與結(jié)果：
　　ELISA及Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HP-API保持了API的大部分的抗體特性，能與多肽片段PAP248-286抗原及PAP248-286震蕩形成的淀粉樣纖維SEVI結(jié)合。HP-API本身有具有高抗HIV活性，能對(duì)抗多種HIV-1實(shí)驗(yàn)室及臨床分離株的感染，其IC50均較低。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)HP-API還能有效抑制各種抗病毒藥物耐

9、藥病毒株的感染。通過time-of-addition、細(xì)胞與細(xì)胞融合、病毒與細(xì)胞融合及病毒細(xì)胞與細(xì)胞間的傳播等實(shí)驗(yàn)說明:HP-API作用于HIV病毒的進(jìn)入階段，是一種HIV病毒進(jìn)入/融合抑制劑，HP-API不抑制HIV病毒感染靶細(xì)胞后期的復(fù)制過程。ELISA和流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，HP-API可以通過與HIV包膜糖蛋白或病毒作用靶細(xì)胞上的CD4分子結(jié)合，干擾包膜糖蛋白與CD4分子的結(jié)合，從而抑制病毒與靶細(xì)胞膜的融合，阻止HIV病毒的進(jìn)

10、入。理想的殺微生物劑必須具備高效，人體安全無毒的特點(diǎn)。為此，我們?cè)u(píng)估了HP-API對(duì)病毒作用靶細(xì)胞和對(duì)正常人陰道的細(xì)胞毒性，包括了MT-2，U87-CD4-CXCR4細(xì)胞和U87-CD4-CCR5細(xì)胞。我們發(fā)現(xiàn)HP-API對(duì)各靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用均較低。
　　進(jìn)一步分析其機(jī)制，我們發(fā)現(xiàn)HP-API能顯著抑制SEVI增強(qiáng)病毒感染作用，而本身的抗病毒活性基本保持不變，而陰性對(duì)照抗體API無任何抗病毒活性（IC50＞75μg/ml）。S

11、EVI沉淀部分的增強(qiáng)病毒感染活性較強(qiáng)，與SEVI的混合物較為相似，HP-API能顯著抑制SEVI淀粉樣纖維增強(qiáng)HIV-1感染的能力。但SEVI的上清部分增強(qiáng)病毒感染的活性較弱，基本與PBS相似，HP-API或API與PAP248-286多肽能特異性結(jié)合，肝素并不能拮抗HP-API或API與PAP248-286結(jié)合，說明HP-API及API與PAP248-286的結(jié)合的確是抗原抗體之間的特異性結(jié)合。采用剛果紅溶液及硫磺素T，透射電子顯微鏡

12、，圓二色譜法等方法，我們發(fā)現(xiàn)HP-API或API能濃度依賴性地抑制PAP248-286多肽形成淀粉樣纖維，我們進(jìn)一步采用硫磺素T(ThT)法檢測(cè)HP-API及API對(duì)已經(jīng)形成的成熟的SEVI淀粉樣纖維的分解作用發(fā)現(xiàn)，HP-API及API均不能降解已經(jīng)形成的SEVI淀粉樣纖維，說明兩者均在淀粉樣纖維聚集過程中起抑制作用，而對(duì)淀粉樣纖維無分解作用，我們采用熒光共聚焦顯微鏡，病毒pull-down方法檢測(cè)SEVI或精液促進(jìn)HIV-1病毒顆粒聚

13、集，發(fā)現(xiàn)這種聚集能被HP-API抑制。
　　結(jié)論：
　　3-羥基-鄰苯二甲酸酐修飾抗SEVI抗體(HP-API)是阻止病毒進(jìn)入和與SEVI淀粉樣原纖維結(jié)合的廣譜HIV進(jìn)入/融合抑制劑。HP-API可以對(duì)抗艾滋病病毒SEVI淀粉樣原纖維增強(qiáng)效果，同時(shí)抑制病毒感染，因此其具有較大的潛能被發(fā)展成預(yù)防HIV性傳播的候選殺微生物劑。1.HP-API具有容易制備、低細(xì)胞毒性和生產(chǎn)成本低的特點(diǎn)，有廣譜的抗病毒活性，可以抗各種HIV-1實(shí)驗(yàn)

14、室病毒株及臨床分離株的感染，甚至還可以抑制幾種臨床常用的抗病毒藥物的耐藥株的感染;2.研究HP-API的作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)，HP-API是通過與HIV病毒包膜糖蛋白或病毒作用靶細(xì)胞的CD4分子結(jié)合，干擾病毒包膜糖蛋白與CD4分子的結(jié)合，從而抑制病毒與靶細(xì)胞膜的融合，阻止HIV病毒的進(jìn)入。HP-API結(jié)合PAP248-286或SEVI能力很強(qiáng)，該特異性結(jié)合不受高負(fù)電荷的肝素影響，HP-API在體外抑制PAP248-286形成SEVI淀粉樣纖維，