人胰島淀粉樣多肽11-20片段聚集行為和肽抑制劑的研究.pdf

1、構(gòu)象病是由于蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊引起的一種疾病，其典型特征為具有正常功能的蛋白質(zhì)構(gòu)型發(fā)生非正常變化，引起錯(cuò)誤折疊，導(dǎo)致蛋白質(zhì)從正常形態(tài)逐漸變?yōu)楦缓罅喀抡郫B結(jié)構(gòu)的淀粉樣斑塊，沉積在組織器官中，從而使細(xì)胞功能衰退直至凋亡。2型糖尿病作為一種常見的構(gòu)象病，由于它患病人數(shù)逐年增加，已經(jīng)成為一種嚴(yán)重危害人類生活質(zhì)量和身體健康的流行性疾病。胰島淀粉樣多肽的纖維化沉積被認(rèn)為是2型糖尿病的主要病理特征之一。雖然口服降糖藥以及直接注射胰島素均可用于治療2型糖

2、尿病，但是此種干預(yù)性治療只能初步改善和維持正常血糖值，在治療后期，隨著并發(fā)癥逐漸發(fā)生，此種治療方法具有一定局限性。胰島淀粉樣多肽聚集形成的淀粉樣纖維能夠破壞胰島β細(xì)胞膜，導(dǎo)致β細(xì)胞逐漸凋亡，加劇了2型糖尿病的病癥。抑制胰島淀粉樣多肽的聚集能夠減緩2型糖尿病的病發(fā)，因此研發(fā)抑制胰島淀粉樣多肽聚集抑制劑為2型糖尿病的治療提供了一種新方法。
　　人胰島淀粉樣多肽(hIAPP)的不同片段具有不同性質(zhì)，阻斷 hIAPP自身π-π堆積作用，可

3、以有效減弱 hIAPP成淀粉樣纖維的能力。因此本論文針對人胰島淀粉樣多肽自聚集行為進(jìn)行了研究并設(shè)計(jì)合成了多種多肽類抑制劑。首先，本研究以牛血清白蛋白(BSA)為模版蛋白，運(yùn)用微量熱泳動(dòng)技術(shù)(MST)建立了一種能夠研究蛋白聚集行為的方法，考察了人胰島淀粉樣多肽片段11-20(hIAPP11-20)在不同溶液中聚集行為，最終以hIAPP11-20為目標(biāo)物，設(shè)計(jì)并合成了一系列具有不同構(gòu)型的多肽，考察了它們對hIAPP11-20淀粉樣纖維形成的

4、抑制效果，探討了影響hIAPP11-20淀粉樣纖維形成的主要因素。具體研究內(nèi)容如下：
　　1.運(yùn)用微量熱泳動(dòng)技術(shù)建立研究蛋白聚集行為的方法
　　在藥物研發(fā)過程中，探究蛋白與其目標(biāo)分子的結(jié)合行為為藥物分子設(shè)計(jì)提供了大量的基本信息。本實(shí)驗(yàn)以牛血清白蛋白(BSA)為模板蛋白，分別運(yùn)用微量熱泳動(dòng)技術(shù)(MST)和普通熒光猝滅方法，考察了 BSA與一種常見小分子異硫氰酸鈉(FITC)之間的相互作用。MST實(shí)驗(yàn)表明，在短時(shí)間內(nèi)，BSA與F

5、ITC發(fā)生了兩種形式的相互作用。在MST競爭實(shí)驗(yàn)中，以華法林和布洛芬分別為BSA不同位點(diǎn)的特異性結(jié)合標(biāo)記物，結(jié)果表明，F(xiàn)ITC主要與BSA的位點(diǎn)II位結(jié)合，但也與位點(diǎn)I位有少量結(jié)合，同時(shí)也證明了FITC并不以標(biāo)記的形式與BSA發(fā)生相互作用，而是與BSA聚集體發(fā)生結(jié)合，從而表現(xiàn)出2種結(jié)合方式。MST實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)果與熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，進(jìn)一步表明MST在研究生物分子間相互作用中的可靠性。因此，MST不僅可以為生物分子間相互作用提供大量有用的

6、信息，也可以研究蛋白聚集行為，獲得其它方法不能得到的信息。
　　2. hIAPP11-20在不同溶液中的聚集行為研究
　　hIAPP11-20能夠在體外形成與全長類似的富含β折疊的淀粉樣纖維，因此選擇hIAPP11-20作為探究淀粉樣多肽聚集行為的目標(biāo)物。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用MST技術(shù)和傳統(tǒng)的ThT熒光法，考察了hIAPP11-20在不同溶液(Tris-HCl, HEPES, PBS和超純水)中的淀粉樣纖維的形成過程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，h

7、IAPP11-20在不同溶液中表現(xiàn)出不同的聚集行為，hIAPP11-20不僅與自身發(fā)生相互作用，也可能與溶質(zhì)分子發(fā)生結(jié)合，說明緩沖溶液不僅只是起到維持溶液環(huán)境穩(wěn)定的作用，還有可能參與目標(biāo)分子的相互作用。hIAPP11-20與Tris的親和力遠(yuǎn)大于hIAPP11-20與其它溶質(zhì)分子的親和力，說明hIAPP11-20在Tris-HCl緩沖溶液中自聚能力要遠(yuǎn)小于hIAPP11-20在其它溶液中的自聚能力。在HEPES和超純水中，hIAPP11

8、-20表現(xiàn)出相似的自聚集行為。PBS緩沖溶液中帶負(fù)電的磷酸根離子可能會“中和”一部分hIAPP11-20自身的正電，從而導(dǎo)致hIAPP11-20在PBS中快速形成淀粉樣纖維聚集。因此，在研究hIAPP11-20淀粉樣纖維化過程時(shí)，緩沖溶液的影響需考慮在內(nèi)。同時(shí)，MST技術(shù)也為研究多肽或蛋白的早期聚集行為提供了一種簡單有效的方法。
　　3.新型阻斷肽抑制hIAPP11-20聚集效果的研究
　　hIAPP錯(cuò)誤折疊所產(chǎn)生的淀粉樣纖

9、維是2型糖尿病的一種重要病理特征。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并合成了17條具有不同長度，構(gòu)型以及組成的多肽類抑制劑，以hIAPP11-20為模板，考察了它們抑制hIAPP11-20淀粉樣纖維形成的效果。通過MST實(shí)驗(yàn)以及ThT熒光實(shí)驗(yàn)深入探究了這些多肽抑制hIAPP11-20淀粉樣纖維形成的機(jī)理，并用TEM表征了hIAPP11-20最終形成淀粉樣纖維的形貌。結(jié)果表明短肽AT、SA、RF、KS、KT和KN，以及環(huán)肽cyclic-KS、cyclic-KT和

10、cyclic-KN能夠有效抑制hIAPP11-20淀粉樣纖維的形成。其中，芳香型氨基酸的種類，多肽氨基酸的特定組成以及多肽的構(gòu)型在抑制淀粉樣纖維形成中起重要作用。MST實(shí)驗(yàn)量化了hIAPP11-20與多肽之間的親和力，表明具有較高親和力的多肽在抑制聚集中表現(xiàn)出良好的抑制效果，該結(jié)果與 ThT熒光實(shí)驗(yàn)以及分子對接結(jié)果相一致。因此，MST是一種簡單快速的方法，可用于初步篩選聚集抑制劑。本研究也為以后設(shè)計(jì)多肽抑制劑提供了一些實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)也為

11、探究其他蛋白構(gòu)象病的抑制劑擴(kuò)展了思路。
　　4.脂肽抑制hIAPP11-20聚集效果的研究
　　根據(jù)有些脂肽能夠保護(hù)細(xì)胞免受淀粉樣纖維破環(huán)，而且脂肽與報(bào)道的抑制劑均含有較多的疏水基團(tuán)等特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了一系列新型脂肽，以hIAPP11-20為探究淀粉樣多肽聚集的目標(biāo)物，考察了這些脂肽抑制hIAPP11-20淀粉樣纖維形成的效果。我們通過 MST、ThT熒光實(shí)驗(yàn)深入討論了這些脂肽抑制聚集的機(jī)理，同時(shí)利用TEM表征了hIAPP1

12、1-20最終形成淀粉樣纖維的形貌及hIAPP11-20與脂肽共同孵育后的hIAPP11-20聚集形貌。結(jié)果表明，隨著脂肽鏈長的逐漸增加，其抑制 hIAPP11-20聚集的效果逐漸增強(qiáng)。另外，含正電氨基酸的數(shù)量也在抑制hIAPP11-20淀粉樣纖維形成中起到一定作用。因此，本實(shí)驗(yàn)拓寬了hIAPP淀粉樣纖維化抑制劑的研究范圍。
　　本論文通過運(yùn)用 MST建立了一種能夠研究蛋白聚集行為的方法，并采用該方法聯(lián)合使用其他技術(shù)考察了hIAPP