基于腫瘤酸性微環(huán)境響應(yīng)的親疏水性反轉(zhuǎn)納米凝膠載藥系統(tǒng)的研究.pdf

1、體內(nèi)復(fù)雜的生理屏障影響著納米載藥系統(tǒng)對(duì)抗腫瘤藥物靶向輸送的效率。理想的納米載藥系統(tǒng)需實(shí)現(xiàn)血液中的長(zhǎng)循環(huán)、腫瘤部位的高度蓄積與深部穿透、腫瘤細(xì)胞的有效攝取及胞內(nèi)定點(diǎn)釋藥，而納米載藥系統(tǒng)的物理化學(xué)性質(zhì)，如粒徑、表面電位、聚乙二醇（poly(Ethylene glycol)，PEG）密度及表面功能團(tuán)等影響其最終生物學(xué)效應(yīng)。體內(nèi)過(guò)程不同階段所處的環(huán)境對(duì)納米載藥系統(tǒng)理化性質(zhì)提出的要求不盡相同，甚至是矛盾的。因此根據(jù)粒徑及電荷對(duì)納米載藥系統(tǒng)的體內(nèi)過(guò)

2、程影響而發(fā)展的電荷反轉(zhuǎn)型及粒徑反轉(zhuǎn)型納米載藥系統(tǒng)得到極大關(guān)注，而納米載藥系統(tǒng)表面的親疏水性對(duì)體內(nèi)過(guò)程及生物學(xué)效應(yīng)研究卻較少。親水性納米載藥系統(tǒng)通過(guò)避免血液中蛋白的吸附及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（Reticuloendothelial System，RES）的吞噬作用有利于血液長(zhǎng)循環(huán)，而疏水性納米載藥系統(tǒng)則通過(guò)疏水作用增強(qiáng)與腫瘤細(xì)胞膜的相互作用，因而有利于腫瘤細(xì)胞的攝取，因此親疏水性反轉(zhuǎn)型納米載藥系統(tǒng)能有效解決血液長(zhǎng)循環(huán)與腫瘤細(xì)胞攝取過(guò)程中存在的矛盾

3、。PEG有利于增加納米載藥系統(tǒng)的親水性，利用腫瘤酸性微環(huán)境將PEG斷裂有利于增加其疏水性，由此解決PEG困境。但這種親疏水性反轉(zhuǎn)策略通常依賴(lài)于pH誘發(fā)的化學(xué)鍵斷裂，常常需要耗費(fèi)較長(zhǎng)時(shí)間而影響其最終腫瘤抑制效果的發(fā)揮。同時(shí)納米載藥系統(tǒng)親疏水性對(duì)其腫瘤組織深部穿透影響未見(jiàn)報(bào)道。本課題組前期工作提出利用納米凝膠在微酸性環(huán)境中的親疏水性反轉(zhuǎn)有利于促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)納米凝膠的攝取，同時(shí)納米凝膠由于在三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中包含大量水分子而具備良好的親水性，而其

4、親疏水性的改變則依賴(lài)于結(jié)構(gòu)中功能基團(tuán)的質(zhì)子化與去質(zhì)子化，因此變化迅速。這種基于親疏水性反轉(zhuǎn)納米凝膠的載藥系統(tǒng)為腫瘤微環(huán)境響應(yīng)型納米載藥系統(tǒng)研究提供了新的思路。本文構(gòu)建了pH調(diào)控的親疏水性反轉(zhuǎn)納米凝膠，系統(tǒng)研究其長(zhǎng)循環(huán)、腫瘤部位富集及腫瘤深部穿透的影響。為進(jìn)一步增強(qiáng)納米凝膠載藥系統(tǒng)的抗腫瘤效果，還賦予此載藥納米凝膠pH調(diào)控的電荷反轉(zhuǎn)及GSH（Glutatione，谷胱甘肽）響應(yīng)的藥物釋放性能，以促進(jìn)其溶酶體逃逸及胞內(nèi)GSH響應(yīng)性釋藥。

5、r>　　主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　　1)通過(guò)調(diào)節(jié)溫度敏感聚合物N-異丙基丙烯酰胺（N-Isopropyl Acrylamide，NIPAM）、pH敏感N-甲基烯丙基胺（Methylallyl Amine，MAA）和兩性聚離子單體磺基甜菜堿甲基丙烯酸甲酯（Sulfobetaine Methacrylate，SBMA）單體的比例，合成了具有pH調(diào)控的親疏水性反轉(zhuǎn)/電荷反轉(zhuǎn)能力的PNSM納米凝膠（簡(jiǎn)稱(chēng)為R-納米凝膠）。該凝膠通過(guò)N,N

6、'-雙(丙烯酰)胱胺（N,N'-Bis(acryloyl)cystamine)，BAC）交聯(lián)而成，交聯(lián)劑中二硫鍵同時(shí)也賦予PNSM納米凝膠氧化還原響應(yīng)性。同時(shí)通過(guò)調(diào)控NIPAM，MAA及SBMA比例合成了無(wú)pH調(diào)控的親疏水性反轉(zhuǎn)性能的C-納米凝膠。通過(guò)透過(guò)率檢測(cè)法及粒徑分析法確證了R-納米凝膠在血液及正常組織的生理?xiàng)l件下（pH7.4，37℃）為親水狀態(tài)，而在腫瘤酸性微環(huán)境中（pH6.5，37℃）能迅速實(shí)現(xiàn)親疏水性反轉(zhuǎn)。C-納米凝膠則在p

7、H7.4及6.5均為親水狀態(tài)。R-納米凝膠在pH4.5條件下能有效實(shí)現(xiàn)電荷反轉(zhuǎn)，其在溶酶體酸性環(huán)境中具有質(zhì)子海綿效應(yīng)。通過(guò)有機(jī)溶劑揮發(fā)法將阿霉素載入其中，體外釋放實(shí)驗(yàn)表明R-載藥納米凝膠具有pH及GSH響應(yīng)性。比較了不同pH條件下C-納米凝膠及R-納米凝膠被胎牛血清蛋白的吸附及巨噬細(xì)胞Raw264.7的吞噬情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)R-納米凝膠pH調(diào)控的親疏水性反轉(zhuǎn)不僅有利于其在pH7.4時(shí)有效避免被胎牛血清蛋白吸附及巨噬細(xì)胞Raw264.7的吞噬

8、，使其具備血液長(zhǎng)循環(huán)的特性，同時(shí)促進(jìn)了HepG2肝癌細(xì)胞及H22腫瘤干細(xì)胞在pH6.5條件下對(duì)R-載藥納米凝膠的攝取及細(xì)胞毒性，可有效解決長(zhǎng)循環(huán)與腫瘤細(xì)胞攝取的矛盾。為了驗(yàn)證R-載藥納米凝膠胞內(nèi)GSH響應(yīng)性釋放藥物特性，我們用谷胱甘肽乙酯（Glutathione Monoethylester，GSH-OEt）對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其能有效提高R-載藥納米凝膠的胞內(nèi)阿霉素?zé)晒鈴?qiáng)度，并促進(jìn)R-載藥納米凝膠對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性

9、作用。我們同時(shí)關(guān)注了PNSM納米凝膠在細(xì)胞器中分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pH調(diào)控的電荷反轉(zhuǎn)有利于R-納米凝膠在腫瘤細(xì)胞進(jìn)行溶酶體逃逸，并進(jìn)一步在胞內(nèi)GSH的作用下釋放阿霉素。
　　2)研究了PNSM納米凝膠在荷瘤小鼠腫瘤部位的蓄積，結(jié)果發(fā)現(xiàn)R-載藥納米凝膠在腫瘤組織中的蓄積含量顯著性高于C-載藥納米凝膠及游離阿霉素給藥組，并且具有一定的腫瘤滯留能力。腫瘤組織的深部穿透是影響納米載藥系統(tǒng)發(fā)揮腫瘤抑制作用的重要阻礙，我們也關(guān)注了PNSM納米凝膠的

10、腫瘤深部穿透能力。結(jié)果表明R-載藥納米凝膠在腫瘤酸性微環(huán)境中的親疏水性反轉(zhuǎn)有利于其在H22腫瘤細(xì)胞團(tuán)模型、離體腫瘤模型及活體腫瘤中的穿透。
　　3)研究了PNSM載藥納米凝膠的腫瘤抑制作用，結(jié)果表明在H22荷瘤小鼠模型中，R-載藥納米凝膠對(duì)荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用顯著性強(qiáng)于C-載藥納米凝膠及游離阿霉素。R-載藥納米凝膠能顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。處于腫瘤深部乏氧區(qū)域的腫瘤干細(xì)胞與腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移有關(guān)，因此我們也研

11、究了PNSM載藥納米凝膠對(duì)腫瘤干細(xì)胞的毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)R-載藥納米凝膠對(duì)H22腫瘤干細(xì)胞也具有更強(qiáng)的殺傷效果。PNSM納米凝膠本身具有良好的安全性，并能降低負(fù)載阿霉素的心臟毒性。
　　4)為了進(jìn)一步確證pH調(diào)控的親疏水性反轉(zhuǎn)策略的有效性及普適性，我們用生物相容性好的溫敏性寡聚乙二醇及pH敏感的丙烯酸（Acrylic Acid，AA）為單體，通過(guò)BAC交聯(lián)，構(gòu)建pH調(diào)控的親疏水性反轉(zhuǎn)及氧化還原響應(yīng)型P(OEGMAs-ss-AA)納米凝

12、膠。研究了pH調(diào)控的親疏水性反轉(zhuǎn)對(duì)其蛋白吸附及被腫瘤細(xì)胞攝取的影響，結(jié)果證實(shí)通過(guò)腫瘤微環(huán)境中親疏水性反轉(zhuǎn)策略能有效解決P(OEGMAs-ss-AA)納米凝膠血液長(zhǎng)循環(huán)與腫瘤細(xì)胞攝取之間的矛盾。我們也深入研究了P(OEGMAs-ss-AA)載藥納米凝膠的胞內(nèi)命運(yùn)，結(jié)果表明該載藥納米凝膠通過(guò)脂筏依賴(lài)的內(nèi)吞途徑及網(wǎng)格蛋白依賴(lài)的內(nèi)吞途徑一同進(jìn)入Bel7402細(xì)胞，在經(jīng)歷了早期內(nèi)含體及晚期內(nèi)含體的傳輸過(guò)程后進(jìn)入溶酶體，而后釋放阿霉素進(jìn)入細(xì)胞核中，

13、最終發(fā)揮細(xì)胞毒作用。
　　綜上所述，pH調(diào)控的親疏水性反轉(zhuǎn)型納米凝膠在機(jī)體的血液及正常組織中為親水狀態(tài)，有利于納米凝膠在血液中減少蛋白的吸附及RES的吞噬，因而具有血液長(zhǎng)循環(huán)的特性；而在腫瘤酸性微環(huán)境中反轉(zhuǎn)成為疏水的狀態(tài)，有利于其被腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞攝取，因而能有效解決血液長(zhǎng)循環(huán)與腫瘤細(xì)胞攝取的矛盾。pH調(diào)控的親疏水性反轉(zhuǎn)特性也有利于納米凝膠在腫瘤組織的有效富集及深部穿透。而pH調(diào)控的電荷反轉(zhuǎn)特性則能使納米凝膠在腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)溶酶