基于GFP的FRET監(jiān)測樹突棘鈣動力學(xué).pdf

1、細(xì)胞內(nèi)鈣離子作為傳遞信息的第二信使，對細(xì)胞生長分化起著重要作用。神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放、細(xì)胞間信息傳遞、樹突的生長、樹突棘的形成及突觸可塑性等都與細(xì)胞內(nèi)鈣離子有著密不可分的關(guān)系。研究表明，樹突棘內(nèi)的鈣離子參與調(diào)控多種信號途徑，并且對長時程增強（LTP）和長時程抑制（LTD）有著重要貢獻，而LTP和LTD目前被認(rèn)為是學(xué)習(xí)和記憶的神經(jīng)基礎(chǔ)。因此監(jiān)測海馬神經(jīng)元單個樹突棘的鈣濃度變化是研究突觸可塑性分子和細(xì)胞機制的關(guān)鍵。激光共聚焦顯微鏡

2、和鈣離子熒光探針的發(fā)展實現(xiàn)了生理狀態(tài)下樹突棘內(nèi)鈣信號的檢測。激光掃描共聚焦顯微鏡具有散射背景小、色差小、分辨率高等優(yōu)勢?；蛱结樖莾?nèi)源性大分子對細(xì)胞鈣動力學(xué)影響小，同時，采用Ratio成像可以定量探測鈣離子濃度。本實驗使用基于GFP的鈣離子基因探針——Cameleon來研究了樹突棘的鈣動力學(xué)。首先，優(yōu)化了細(xì)胞培養(yǎng)、磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法，使用458nm激光代替430nm激光來進行熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）探測。然后，比較了不同Cameleon

3、的動態(tài)范圍，458nm激發(fā)時YC2.1、YC6.1和YC3.60FRET比值的變化范圍分別為：33﹪，70﹪，220﹪。最后，初步完善了FRET定量鈣濃度的方法，應(yīng)用于：（1）靜息狀態(tài)下的鈣分布。在靜息狀態(tài)下，海馬神經(jīng)元的胞體、一級樹突、二級樹突、三級樹突和樹突棘內(nèi)鈣離子濃度分別為：104±22nM，71±10nM，55±6nM，40±7nM，56±14nM，樹突棘的鈣離子濃度高于對應(yīng)的樹突證實了樹突頸擴散屏障的功能；同時發(fā)現(xiàn)，靜息狀態(tài)

4、下樹突棘內(nèi)鈣離子濃度分布范圍13~80nM，這種鈣離子濃度的差異可能與樹突棘的成熟度、功能以及鈣運作方式等有關(guān)。（2）生理刺激對胞體和樹突棘內(nèi)鈣離子濃度的影響。吹加谷氨酸來研究了神經(jīng)元的胞體和樹突棘的鈣動力學(xué)，在100μM的谷氨酸的刺激下胞體內(nèi)鈣離子濃度從100nM上升到1μM左右，而樹突棘內(nèi)鈣離子濃度從50nM上升達(dá)到500nM。結(jié)果表明，利用Cameleon的FRET比值變化來定量監(jiān)測樹突棘鈣動力學(xué)的方法是切實可行的，并可以進行實時