通絡(luò)干預(yù)對(duì)高血壓病靶器官損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、本文分為以下幾個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　論文Ⅰ通心絡(luò)對(duì)高血壓病心肌纖維化的作用及機(jī)制研究
　　目的:
　　1.觀察通心絡(luò)對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和功能異常的影響;
　　2.觀察通心絡(luò)對(duì)AngⅡ引起的心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和活化的影響，以及對(duì)心臟細(xì)胞微環(huán)境的調(diào)節(jié);
　　3.探討通心絡(luò)發(fā)揮作用的具體機(jī)制，以及與miR-133a的關(guān)系。
　　方法：
　　1.原代心肌成纖維細(xì)胞和心臟微血管內(nèi)皮

2、細(xì)胞分離、鑒定和培養(yǎng)
　　利用酶消化法和差速分離技術(shù)自Wistar乳鼠（出生1-3天內(nèi)）的心臟分離原代心肌成纖維細(xì)胞和心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞。分別利用成纖維特異性蛋白(FSP)-1抗體、乙?；兔芏戎?DiI-ac-LDL)抗體和CD31抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色以鑒定心肌成纖維細(xì)胞和心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第2-3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　2.篩選通心絡(luò)溶液對(duì)細(xì)胞活性作用的合適濃度區(qū)間和時(shí)間
　　采用CCK-8方

3、法進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)，以分別篩選通心絡(luò)溶液對(duì)心肌成纖維細(xì)胞和心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的合適濃度區(qū)間和時(shí)間。
　　3.心肌成纖維細(xì)胞的分組與干預(yù)
　　(1)觀察通心絡(luò)對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響以及其篩選最佳作用濃度:分為空白對(duì)照組(control組)、陽性對(duì)照組(AngⅡ組)、各實(shí)驗(yàn)組(AngⅡ+不同濃度通心絡(luò)溶液）。按分組僅給予培養(yǎng)基或給予培養(yǎng)基、通心絡(luò)溶液和/或AngⅡ100 nM刺激24小時(shí)。提取蛋白，檢測(cè)α-

4、SMA蛋白表達(dá)，觀察通心絡(luò)對(duì)心肌成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化的影響。(2)根據(jù)干預(yù)因素分組:分為空白對(duì)照組(control組)、陽性對(duì)照組(AngⅡ組)、陰性對(duì)照組(negative control組，AngⅡ+ScrambledsiRNA轉(zhuǎn)染+通心絡(luò))和實(shí)驗(yàn)組(treat組，AngⅡ+miR-133a inhibitors轉(zhuǎn)染+通心絡(luò))。
　　結(jié)果：
　　1.通心絡(luò)抑制了AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化
　　(1)通心

5、絡(luò)作用于心肌成纖維細(xì)胞的適宜濃度范圍和時(shí)間的篩選
　　濃度在400μg/mL以內(nèi)的通心絡(luò)溶液是實(shí)驗(yàn)的適宜濃度范圍;24h對(duì)細(xì)胞活力影響最小。
　　(2)通心絡(luò)抑制了AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞的α-SMA蛋白的表達(dá)。
　　與空白對(duì)照組比較，AngⅡ顯著增加了心肌成纖維細(xì)胞α-SMA的表達(dá)水平而不同濃度的通心絡(luò)均顯著抑制了AngⅡ誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞的α-SMA表達(dá);通心絡(luò)在400μg/mL的濃度時(shí)產(chǎn)生了最大的抑制作用，該

6、濃度作為心肌成纖維細(xì)胞后續(xù)實(shí)驗(yàn)的適宜濃度。
　　(3)通心絡(luò)抑制了AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞的功能活化。
　　與空白對(duì)照組比較，AngⅡ顯著增加了心肌成纖維細(xì)胞3H-羥脯氨酸摻入量;通心絡(luò)顯著抑制了AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞3H-羥脯氨酸摻入量。
　　與空白對(duì)照組比較，AngⅡ顯著增加了心肌成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原和IL-6的分泌;通心絡(luò)顯著抑制了AngⅡ誘導(dǎo)的Ⅰ型膠原和IL-6的分泌。
　　與空白對(duì)照組比較，An

7、gⅡ顯著增加了心肌成纖維細(xì)胞遷移能力;通心絡(luò)顯著抑制了AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞遷移能力。
　　2.通心絡(luò)改善了AngⅡ誘導(dǎo)的心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和活化
　　(1)通心絡(luò)作用于心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的適宜濃度范圍和時(shí)間的篩選
　　使用濃度在400μg/mL以內(nèi)的通心絡(luò)溶液是實(shí)驗(yàn)的適宜濃度范圍。同時(shí)，結(jié)果顯示400μg/mL的通心絡(luò)在24h內(nèi)對(duì)細(xì)胞活性無顯著影響。
　　(2)通心絡(luò)改善了AngⅡ損傷的心臟微血管內(nèi)

8、皮細(xì)胞的體外成管功能
　　與空白對(duì)照組比較，AngⅡ顯著抑制了心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外成管功能。不同濃度的通心絡(luò)均顯著改善了心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的成管功能;通心絡(luò)在400μg/mL的濃度時(shí)產(chǎn)生了最大的作用。
　　(3)通心絡(luò)對(duì)AngⅡ作用下的心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞NO含量以及CTGF和IL-6分泌的影響
　　空白對(duì)照組比較，AngⅡ顯著減少心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的NO含量并增加了CTGF和IL-6分泌量;而通心絡(luò)干預(yù)顯著增加了N

9、O含量并減少了CTGF和IL-6分泌量。
　　結(jié)論：
　　1.通心絡(luò)抑制了AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和功能活化，其作用與促進(jìn)miR-133a表達(dá)、抑制促纖維生成相關(guān)的信號(hào)通路Smad3/CTGF有關(guān);
　　2.通心絡(luò)保護(hù)了AngⅡ損傷的心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能狀態(tài)，其作用與促進(jìn)miR-133a表達(dá)、抑制caveolin-1表達(dá)、活化血管內(nèi)皮保護(hù)相關(guān)的信號(hào)通路eNOS/NO有關(guān);
　　3.通心絡(luò)抑制了心臟

10、微血管內(nèi)皮細(xì)胞的活化，改善了其異常代謝與分泌功能，從而調(diào)節(jié)了促心肌成纖維細(xì)胞活化和促纖維形成的細(xì)胞微環(huán)境。
　　論文Ⅱ 通心絡(luò)對(duì)高血壓病心肌纖維化的作用及機(jī)制研究（動(dòng)物實(shí)驗(yàn)）
　　目的:
　　1.觀察通心絡(luò)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠的心肌纖維化和與促纖維生成的心臟微環(huán)境（微血管生成和炎癥反應(yīng)）的影響;
　　2.探討通心絡(luò)在自發(fā)性高血壓大鼠體內(nèi)作用機(jī)制，及與miR-133a的關(guān)系。
　　方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

11、的分組
　　將40只8周齡雄性SHR隨機(jī)分為通心絡(luò)不同劑量治療組即高劑量治療組、中劑量治療組和低劑量治療組，以及陽性對(duì)照組，每組各10只。10只8周齡雄性Wistar大鼠作為正常對(duì)照組。
　　2.血壓和心功能的測(cè)量
　　采用無創(chuàng)血壓計(jì)測(cè)量大鼠尾動(dòng)脈壓;采用二維、M超、組織多普勒和脈沖多普勒超聲成像技術(shù)評(píng)價(jià)大鼠左室舒張和收縮功能。
　　3.組織病理學(xué)分析
　　將大鼠心臟標(biāo)本制備為石蠟切片，進(jìn)行心肌膠原的Mas

12、son染色，并計(jì)算膠原膠原容積分?jǐn)?shù)。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色，觀察心臟組織CD31的表達(dá)并計(jì)算心臟微血管密度。
　　結(jié)果：
　　1.通心絡(luò)降低了SHR的收縮壓
　　SHR組及通心絡(luò)不同劑量組血壓顯著高于WKY組;與SHR比較，通心絡(luò)治療顯著抑制了SHR血壓升高的趨勢(shì)。各不同劑量治療組間沒有顯著性差異。
　　2.通心絡(luò)改善了SHR心臟舒張功能
　　SHR組及通心絡(luò)不同劑量組的左室舒張功能E/A值、左室壁動(dòng)度E'/

13、A'值顯著低于WKY組。與SHR組比較，通心絡(luò)不同劑量組的E/A值、E'/A'值顯著升高。但各劑量組間并沒有顯著差異。
　　與WKY組比較，SHR組及通心絡(luò)不同劑量組的EF及FS值無顯著差異。
　　3.通心絡(luò)減輕了SHR心肌纖維化程度
　　SHR組及通心絡(luò)不同劑量組的膠原容積分?jǐn)?shù)明顯高于WKY組。與SHR組比較，通心絡(luò)不同劑量組的CVR顯著降低;但各劑量組間并沒有顯著差異。
　　SHR組及通心絡(luò)不同劑量組的Col

14、I的表達(dá)明顯高于WKY組。與SHR組比較，通心絡(luò)不同劑量組的ColI的表達(dá)顯著降低;但各劑量組間并沒有顯著差異。
　　SHR組及通心絡(luò)不同劑量組的α-SMA的表達(dá)明顯高于WKY組。與SHR組比較，通心絡(luò)不同劑量組的α-SMA的表達(dá)顯著降低(p＜0.05);但各劑量組間并沒有顯著差異。
　　結(jié)論：
　　1.通心絡(luò)可以改善高血壓病心肌纖維化，以及通過增加心臟微血管密度和減輕心臟炎癥水平，糾正了促纖維生成的心臟微環(huán)境改變，從

15、而較好的改善了心臟的功能和結(jié)構(gòu)重塑;
　　2.在體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了通心絡(luò)可以調(diào)節(jié)SHR心臟miR-133a的表達(dá)水平，并影響miR-133a調(diào)控的下游靶基因相關(guān)的促纖維化和促血管生成相關(guān)的信號(hào)通路;
　　3.以通心絡(luò)為代表的通絡(luò)干預(yù)適用于心肌纖維化的治療。
　　論文Ⅲ 通心絡(luò)對(duì)高血壓病腎損害的作用及機(jī)制研究
　　目的：
　　1.觀察通心絡(luò)對(duì)SHR高血壓病腎損傷在結(jié)構(gòu)和功能的影響;
　　2

16、.探討通心絡(luò)對(duì)SHR腎臟氧化應(yīng)激與抗氧化機(jī)制的影響;
　　3.探討通心絡(luò)對(duì)SHR高血壓病腎損傷的可能的作用機(jī)制，及其與FoxO1信號(hào)通路及其轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機(jī)制的關(guān)系。
　　方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組
　　自發(fā)性高血壓大鼠作為原發(fā)性高血壓的動(dòng)物模型。將20只8周齡雄性SHR隨機(jī)分為通心絡(luò)治療組，以及陽性對(duì)照組，每組各10只。10只8周齡WistarKyoto大鼠作為正常對(duì)照組。通心絡(luò)溶于生理鹽水配成溶液，通心絡(luò)治療

17、組每天分別按每千克體重給予SHR0.38g通心絡(luò)溶液灌胃。正常對(duì)照組(WKY組)和陽性對(duì)照組(SHR組)每天給予等量生理鹽水灌胃。
　　2.血壓的測(cè)量
　　采用無創(chuàng)血壓計(jì)測(cè)量大鼠尾動(dòng)脈壓。
　　3.腎功能參數(shù)的測(cè)量
　　采用ELISA法分析尿蛋白、血清和尿肌酐，并計(jì)算尿蛋白排泌率和肌酐清除率。
　　結(jié)果：
　　1.通心絡(luò)降低了SHR的血壓。
　　與對(duì)照組比較，通心絡(luò)治療組的收縮壓顯著下降。

18、>　　2.通心絡(luò)減輕了SHR的腎功能損傷。
　　與對(duì)照組比較，通心絡(luò)治療組的尿蛋白排泌率和肌酐清除率顯著下降。
　　3.通心絡(luò)減輕了SHR腎臟氧化應(yīng)激損傷。
　　與對(duì)照組比較，通心絡(luò)治療組的腎臟MDA、蛋白質(zhì)羰基、NOX活性及亞單位mRNA表達(dá)顯著減少。
　　結(jié)論：
　　1.通心絡(luò)改善了高血壓病腎臟結(jié)構(gòu)和功能的損害;
　　2.通心絡(luò)減輕了高血壓病腎臟氧化應(yīng)激損傷和炎癥，改善了腎臟的抗氧化能力;