βγ-晶狀體蛋白與三葉因子復(fù)合物生物化學(xué)特性與作用機(jī)制研究.pdf

1、bg-CAT是一個(gè)從中國(guó)特有的兩棲動(dòng)物大蹼鈴蟾(Bombina maxima)皮膚分泌物中分離得到的，由非晶狀體bg-晶狀體蛋白(a-亞基，CAT-a)和三葉因子蛋白(b-亞基，CAT-b)天然結(jié)合在一起形成的復(fù)合物，a-亞基與b-亞基通過(guò)非共價(jià)的方式交聯(lián)形成ab2，分子量為72-kDa。CAT-a的N-末端部分(CAT-aN，1-170 氨基酸殘基)是兩個(gè)bg-晶狀體結(jié)構(gòu)域，C-末端部分(CAT-aC)與產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素的膜插入結(jié)構(gòu)

2、域有序列同源性。為了分析bg-CAT的bg-晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)域的生物化學(xué)特性，我們?cè)诖竽c桿菌中分別表達(dá)了CAT-aN，CAT-aC和 CAT-b。對(duì)天然純化的bg-CAT的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明CAT-a與CAT-b形成了一個(gè)緊密的復(fù)合物。Pull-down實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明重組表達(dá)的CAT-b能結(jié)合在重組表達(dá)的CAT-aN上。此外，我們還發(fā)現(xiàn)CAT-aN具有鈣離子結(jié)合模體，存在于其b-折疊構(gòu)象上。重組的CAT-aN 可以結(jié)合鈣離子探針鋱離子，而

3、且CAT-aN在結(jié)合鈣離子后構(gòu)象沒(méi)有發(fā)生明顯的改變。
　　 近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)血小板也會(huì)發(fā)生凋亡，并且這個(gè)凋亡過(guò)程可能在血小板清除中起作用。Bg-CAT在哺乳動(dòng)物中體內(nèi)會(huì)引起很多毒理學(xué)作用，通過(guò)血液學(xué)分析發(fā)現(xiàn)bg-CAT會(huì)引起兔子體內(nèi)血小板數(shù)量發(fā)生顯著的下降。因此，為了研究bg-CAT對(duì)血小板的作用，我們將洗滌后的人血小板與不同濃度的bg-CAT孵育30分鐘，我們發(fā)現(xiàn)bg-CAT使人血小板表現(xiàn)出了多種凋亡特征，如caspase-3

4、的激活，磷脂酰絲氨酸外翻，線粒體膜電位去極化，細(xì)胞色素c的釋放以及促凋亡蛋白Bax和Bak的表達(dá)上調(diào)。同時(shí)，通過(guò)血小板激活檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，如P-選擇素在人血小板表面的表達(dá)，GPIIb/IIIa的激活和血小板聚集等，發(fā)現(xiàn)bg-CAT在引起人血小板凋亡的同時(shí)并不引起血小板的激活。
　　 前期的研究表明,bg-CAT可以在人紅細(xì)胞上形成寡聚體并具有很強(qiáng)的溶血活性。我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)bg-CAT(1 nM)可以引起紅細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度急劇升

5、高從而引起溶血。
　　 然而，在沒(méi)有細(xì)胞外鈣離子存在的情況下（反應(yīng)體系中加入20 mM EGTA），雖然bg-CAT引起的溶血得到顯著抑制，但是bg-CAT仍然可以結(jié)合在紅細(xì)胞膜上并寡聚化。另外，我們發(fā)現(xiàn)bg-CAT在人血小板上引起的磷脂酰絲氨酸外翻和線粒體膜電位的下降也是鈣離子依賴的。綜上所述，我們的數(shù)據(jù)表明CAT-b（三葉因子蛋白）和CAT-aN（bg-晶狀體結(jié)構(gòu)域）在體外可以相互結(jié)合，這為bg-晶狀體蛋白與三葉因子的蛋白在