γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶酶學(xué)性質(zhì)及其催化應(yīng)用研究.pdf

1、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶在生物體內(nèi)廣泛存在，是谷胱甘肽代謝的關(guān)鍵酶之一，隨著生物技術(shù)發(fā)展的快速發(fā)展，利用?-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶制備系列γ-谷氨?；惢衔锏难芯恳殉蔀樯锎呋I(lǐng)域的熱點。目前，本實驗室篩選到一株γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶高產(chǎn)菌株，并已探索了以菌體作為酶源催化合成茶氨酸的生產(chǎn)工藝。在此基礎(chǔ)上，我們作了進(jìn)一步的研究。
　　 目的：
　　 以Bacillus licheniformis C12菌株為γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶制備的菌種來源，通過

2、對其產(chǎn)酶發(fā)酵條件優(yōu)化、提取工藝、酶學(xué)性質(zhì)及固定化該酶催化底物生產(chǎn)茶氨酸進(jìn)行系統(tǒng)研究，為固定化該酶工業(yè)化生產(chǎn)茶氨酸打下基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.產(chǎn)酶發(fā)酵的誘導(dǎo)條件研究：采用底物誘導(dǎo)作用，通過不同底物（甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺）對菌體產(chǎn)酶發(fā)酵進(jìn)行誘導(dǎo)，提高菌體的產(chǎn)酶量。
　　 2.酶的提取及酶學(xué)性質(zhì)研究：采用溶菌酶法、反復(fù)凍融法、超聲波法破碎細(xì)胞壁，高速冷凍離心后獲得?-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶粗酶液，經(jīng)硫酸銨分級沉淀及透

3、析脫鹽初步純化后，得到酶的提取物。采用?-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶常規(guī)測定方法檢測其酶學(xué)性質(zhì)。
　　 3.固定化酶制備及催化條件研究：采用海藻酸鈉包埋戊二醛交聯(lián)法，制備固定化酶，通過正交試驗對固定化酶條件進(jìn)行優(yōu)化。通過采取調(diào)整底物濃度、反應(yīng)溫度、pH 以及添加酶促進(jìn)劑提高固定化酶催化生產(chǎn)茶氨酸量，并采用正交試驗得到最佳的固定化酶催化生產(chǎn)茶氨酸的工藝條件。
　　 結(jié)果：
　　 1.產(chǎn)酶發(fā)酵的誘導(dǎo)條件研究：產(chǎn)酶發(fā)酵24h后添加谷

4、氨酰胺至濃度5mmol/L，誘導(dǎo)2h后，其酶活力最高為7.0U/ml，是對照組的2.26倍。
　　 2.酶提取及酶學(xué)性質(zhì)研究：菌體細(xì)胞破碎的較佳方法為溶菌酶破碎法，其操作條件選擇為每克濕菌體加入2.5mg溶菌酶，35 ℃酶解20min，冷凍離心得粗酶液。再經(jīng)過80-90％飽和度的硫酸銨分級沉淀及透析脫鹽初步純化后，得到酶的提取物。該酶的最適pH為8.0，最適溫度為45 ℃，?-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的轉(zhuǎn)肽反應(yīng)Km為0.73mmol/L。<

5、br>　　 該酶在25-35 ℃的溫度范圍有較好的穩(wěn)定性，在50℃的溫度下保存20min 酶活力基本喪失。該酶在堿性環(huán)境中比較穩(wěn)定，酸性環(huán)境中很容易失活。在Ba 2+，Mg 2+，Ca 2+等金屬離子濃度為5mmol/L的情況下，對該酶的活力均有促進(jìn)作用。
　　 3.固定化酶制備及催化條件研究：①固定化酶制備方法：采用海藻酸鈉包埋戊二醛交聯(lián)法，取一定量的酶提取物，添加含量3.0％的海藻酸鈉包埋，再添加0.25％戊二醛進(jìn)行交聯(lián)，

6、交聯(lián)時間2.5h。制備得到的固定化酶酶活回收率為70.8％。固定化酶的最適pH為9.0，與游離酶相比向酸性方向偏移1.0個單位；固定化酶的最適溫度為37 ℃，比游離酶最適溫度降低了8 ℃。γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶經(jīng)固定化后，熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性都得到了提高。②固定化酶催化條件：研究了Mg 2+及1,6-二磷酸果糖（FDP）發(fā)酵液在轉(zhuǎn)化體系中促進(jìn)合成茶氨酸的作用，通過正交試驗確定Mg 2+及1,6-二磷酸果糖（FDP）發(fā)酵液在轉(zhuǎn)化體系

7、中促進(jìn)合成茶氨酸的較佳條件為2.0mlFDP 發(fā)酵液/30ml 轉(zhuǎn)化液以及Mg 2+濃度為3.0mmol/L。在此條件下固定化酶轉(zhuǎn)化合成茶氨酸量為9.5g/L，相比對照組6.1g/L 提高了55.7％。固定化酶生產(chǎn)茶氨酸的操作穩(wěn)定性比較差，反應(yīng)九批次后，茶氨酸產(chǎn)量只有首批次的31.1％。
　　 結(jié)論：
　　 本研究優(yōu)化了產(chǎn)酶發(fā)酵條件，初步建立了來源于Bacillus licheniformis C12菌株的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽