工作環(huán)境中常見氣傳真菌快速檢測(cè)鑒別的DNA分子標(biāo)記.pdf

1、山東大學(xué)博士學(xué)位論文工作環(huán)境中常見氣傳真菌快速檢測(cè)鑒別的DNA分子標(biāo)記姓名：吳志紅申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：曲音波王曉茹20030228山東大學(xué)博士學(xué)位論文2非放射性探針標(biāo)記雜交技術(shù)。在本實(shí)驗(yàn)室建立了一套非放射性探針標(biāo)記雜交方法，為PCR擴(kuò)增與探針雜交方法相結(jié)合，進(jìn)一步適應(yīng)檢測(cè)實(shí)際樣品中混合狀態(tài)的真菌，提高檢測(cè)的靈敏度奠定技術(shù)基礎(chǔ)。從文獻(xiàn)中摘取了9個(gè)寡核苷酸探針，以常見氣傳真菌的25個(gè)種作為被試菌種，通過非放射性探針標(biāo)記

2、雜交技術(shù)檢測(cè)探針的特異性，并在該雜交系統(tǒng)中優(yōu)化了每一個(gè)探針達(dá)到特異檢測(cè)的雜交溫度。結(jié)果表明，已有探針在新建立的雜交檢測(cè)系統(tǒng)和廣泛的被檢真菌范圍上試驗(yàn)時(shí)，其特異性和特異檢測(cè)條件會(huì)發(fā)生改變，有必要重新試驗(yàn)。3環(huán)境樣品中真菌類群的檢測(cè)。利用血球計(jì)數(shù)板顯微鏡下測(cè)定真菌孢子總數(shù)、MEA和DGl8平板培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)(CFUs)、PCR特異擴(kuò)增和PCR產(chǎn)物探針雜交檢測(cè)4種方法，對(duì)3個(gè)不同工作環(huán)境樣品中的常見氣傳真菌類群進(jìn)行了檢測(cè)，并將不同檢測(cè)方法的結(jié)果

3、進(jìn)行了分析比較。培養(yǎng)結(jié)果表明，盡管不同樣品中真菌孢予含量差異明顯，但是數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)真菌或者是Penicilliumspp或者是Aspergillusspp，培養(yǎng)得到的其它常見氣傳真菌還有Cladosporiumspp、Paecilomycesspp、Rhizopusspp、Chrysoniliaspp、Trichodermaspp和Wallemiasebi。孢子總數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果是平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果的38倍。實(shí)驗(yàn)證明環(huán)境空氣樣品中存在著PCR反應(yīng)抑

4、制因子，在DNA提取過程中抑制因子可進(jìn)入DNA樣品中，通過稀釋DNA的方式可消除PCR抑制效應(yīng)。利用特異PCR引物和探針，我們可以確定在空氣樣品中存在著某類和某種真菌，其中的一些在培養(yǎng)法中未曾檢出。PCR擴(kuò)增方法的檢測(cè)靈敏度為每個(gè)PCR反應(yīng)973孢子、13193CFUs。探針雜交檢測(cè)方法的檢測(cè)靈敏度為每個(gè)PCR反應(yīng)24孢子、0212CFUs。雜交檢測(cè)方法比PCR擴(kuò)增方法更靈敏、更穩(wěn)定，樣品間的差異更小。實(shí)驗(yàn)證明，PCR和探針雜交技術(shù)可以

5、特異、靈敏、準(zhǔn)確地檢測(cè)鑒別樣品中的氣傳真菌，是常規(guī)孢子總數(shù)和菌落數(shù)檢測(cè)方法的良好補(bǔ)充，尤其是PCR為基礎(chǔ)的探針雜交技術(shù)在檢測(cè)環(huán)境樣品、進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測(cè)方面更具有應(yīng)用潛力，但是達(dá)到特異而系統(tǒng)地檢測(cè)環(huán)境樣品中存在的各個(gè)類群，需要建立和發(fā)展更多的特異PCR引物或者特異的雜交探針。418SrRNA系列檢測(cè)探針的建立。我們對(duì)常見氣傳真菌15個(gè)屬31個(gè)種49個(gè)真菌菌株的18SrRNA進(jìn)行了序列測(cè)定。序列分析表明接合菌類(Zygomycota)與子囊菌類