碘過(guò)量對(duì)小鼠甲狀腺炎發(fā)病影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)給予不同品系小鼠飲用碘過(guò)量水、Tg免疫及二者聯(lián)合處理，觀察兩品系小鼠甲狀腺形態(tài)功能的變化，脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子情況，炎癥相關(guān)的趨化因子、凋亡相關(guān)的受體/配體在甲狀腺內(nèi)的表達(dá)及定位，以及甲狀腺內(nèi)炎癥和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平的變化。從而揭示不同環(huán)境因素單獨(dú)和聯(lián)合作用對(duì)誘發(fā)不同遺傳背景個(gè)體自身免疫性甲狀腺炎(AT)影響的差異，并且探討AT時(shí)甲狀腺內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制，為揭示人類自身免疫性甲狀腺炎的病因和發(fā)病機(jī)制

2、提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：選用雌性、7-8周齡的NOD小鼠和BALB/c小鼠。兩品系小鼠均隨機(jī)分為4組：對(duì)照組(C)：飲去離子水；Tg組(Tg)：飲去離子水、在8周齡時(shí)給予每只鼠0.1mgTg皮下免疫，11周齡、15周齡加強(qiáng)免疫兩次；碘過(guò)量組(HI)：飲用0.05％NaI水；碘過(guò)量+Tg組(HI+Tg)：飲0.05％NaI水，Tg免疫同Tg組。在小鼠16周齡時(shí)稱體重、取血、處死全部小鼠，觀察甲狀腺組織大體形態(tài)并稱重；采用

3、HE染色觀察甲狀腺組織形態(tài)學(xué)變化；TUNEL法檢測(cè)甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞凋亡情況；采用RIA法和ELISA法分別檢測(cè)TT4、TgAb、TPOAb和TSH的水平；MTT法檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖情況；ELISA法檢測(cè)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4、IFN-γ、IL-10、IL-12的水平；免疫熒光染色觀察甲狀腺中CD3、CD22、CD31、Podoplanin、CCL21、CCR7、TRAIL、TRAIL-R2(DR5)的表達(dá)及定位；采用SYBR Gree

4、n實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，檢測(cè)甲狀腺中炎癥相關(guān)基因(CCL21、ICAM-1、CXCL10)和凋亡相關(guān)基因(TRAIL、TRAIL-sR1(DR4))的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.甲狀腺組織形態(tài)學(xué)變化：兩品系小鼠HI組和HI+Tg組甲狀腺較C組腫大，絕對(duì)和相對(duì)重量增加(P<0.01)，出現(xiàn)濾泡擴(kuò)張、膠質(zhì)潴留。NOD小鼠這兩組甲狀腺內(nèi)還可見(jiàn)呈灶性分布的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，HI+Tg組伴局部纖維化。
　　 2.血清激

5、素與抗體水平：兩品系小鼠HI組TT4水平較各自C組呈一定程度的下降，同時(shí)TSH水平升高；而Tg組和HI+Tg組TT4和TSH水平均較各自C組升高(P<0.01)。兩品系小鼠Tg免疫后的兩組有TgAb、TPOAb的生成(P<0.01)。
　　 3.淋巴細(xì)胞增殖及脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子水平：體外給予Tg刺激后，除了BALB/c鼠HI組，兩品系小鼠其余各實(shí)驗(yàn)組淋巴細(xì)胞，對(duì)特異性抗原Tg的刺激的增殖數(shù)量與C組比較升高(P<0.01)。

6、細(xì)胞因子水平：NOD小鼠除HI組IL-4水平?jīng)]有變化外，其余細(xì)胞因子(IL-10、IL-12、IFN-γ)水平在各實(shí)驗(yàn)組均較C組升高(P<0.05或0.01)；BALB/c小鼠HI組IL-4、IL-10和IFN-γ三種細(xì)胞因子水平與C組比無(wú)變化，其余兩組這三種細(xì)胞因子水平升高(P<0.01)，而IL-12在各實(shí)驗(yàn)組均表現(xiàn)為水平下降(P<0.01)。
　　 4.甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞凋亡情況：兩品系小鼠C組甲狀腺中偶見(jiàn)弱陽(yáng)性細(xì)胞。NO

7、D小鼠HI和HI+Tg組可見(jiàn)大量陽(yáng)性細(xì)胞，而Tg組和BALB/c小鼠各實(shí)驗(yàn)組較各自C組凋亡細(xì)胞數(shù)量略有增加。
　　 5.TRAIL和受體在甲狀腺內(nèi)的表達(dá)：
　　 免疫熒光染色結(jié)果：NOD小鼠C組甲狀腺不見(jiàn)TRAIL和DR5的表達(dá)；Tg組有散在的TRAIL和DR5的表達(dá)；HI組二者的表達(dá)均增加；HI+Tg組甲狀腺中TRAIL和DR5的表達(dá)進(jìn)一步增加。TRAIL表達(dá)在甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞和浸潤(rùn)的炎細(xì)胞上，并且炎細(xì)胞上TRAIL

8、的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞；而DR5僅表達(dá)在甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞上。BALB/c小鼠各實(shí)驗(yàn)組均有少量TRAIL表達(dá)在甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞或浸潤(rùn)炎細(xì)胞上，但表達(dá)強(qiáng)度明顯弱于NOD小鼠；各組均未見(jiàn)DR5的陽(yáng)性表達(dá)。
　　 基因表達(dá)結(jié)果：NOD小鼠TRAIL的表達(dá)在各實(shí)驗(yàn)組較C組均明顯升高(P<0.01)；DR4的表達(dá)在HI和HI+Tg組明顯升高(P<0.01)，Tg組無(wú)明顯變化。BALB/c小鼠TRAIL和DR4的表達(dá)在聯(lián)合組

9、明顯升高(P<0.01)，Tg組TRAIL的表達(dá)略有升高(P<0.05)，其余與C組無(wú)異。
　　 6.炎癥相關(guān)因子在甲狀腺內(nèi)的表達(dá)：
　　 免疫熒光染色結(jié)果：(1)C組甲狀腺均未見(jiàn)CD3陽(yáng)性細(xì)胞。NOD小鼠Tg組有散在CD3陽(yáng)性細(xì)胞，HI和HI+Tg組可見(jiàn)大量CD3陽(yáng)性淋巴細(xì)胞，HI+Tg組面積更大，且有纖維化出現(xiàn)。而B(niǎo)ALB/c小鼠Tg組和HI組甲狀腺內(nèi)僅有零星CD3陽(yáng)性細(xì)胞；HI+Tg組略有增加。BALB/c小鼠均未

10、見(jiàn)CD22陽(yáng)性細(xì)胞；NOD小鼠Tg組甲狀腺有零星CD22陽(yáng)性細(xì)胞，HI組未見(jiàn)，HI+Tg組甲狀腺炎癥區(qū)內(nèi)有少量CD22陽(yáng)性細(xì)胞。(2)NOD小鼠C組甲狀腺未見(jiàn)CCL21和CCR7的陽(yáng)性表達(dá)；Tg組也不見(jiàn)CCL21的陽(yáng)性表達(dá)，但可見(jiàn)散在的CCR7陽(yáng)性細(xì)胞；在HI組和聯(lián)合組可見(jiàn)局部炎癥區(qū)域有CCL21的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，且在這些部位亦可見(jiàn)CCR7陽(yáng)性細(xì)胞的聚集。CCL21的表達(dá)位于甲狀腺的間質(zhì)部分，呈管腔樣。BALB/c小鼠各組甲狀腺內(nèi)均未見(jiàn)CC

11、L21-CCR7的陽(yáng)性表達(dá)。
　　 基因表達(dá)結(jié)果：NOD小鼠ICAM1、CXCL10、CCL21 mRNA的表達(dá)在各實(shí)驗(yàn)組均較C組明顯升高(P<0.01)；而B(niǎo)ALB/c小鼠，僅HI組和HI+Tg組ICAM1和CXCL10 mRNA的表達(dá)較C組升高(P<0.05或0.01)，其余組沒(méi)變化，CCL21的表達(dá)在各實(shí)驗(yàn)組與C組無(wú)差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.碘過(guò)量可誘發(fā)敏感小鼠發(fā)生EAT，而非敏感小鼠不發(fā)生，說(shuō)明過(guò)量

12、的碘攝入只是誘發(fā)HI的一個(gè)重要環(huán)境因素，遺傳易感性是其發(fā)病的決定因素。
　　 2.碘過(guò)量和Tg免疫均能誘發(fā)敏感品系小鼠發(fā)生EAT，但誘發(fā)途徑不同。Tg作為自身抗原通過(guò)刺激機(jī)體自身免疫反應(yīng)；而碘過(guò)量主要是通過(guò)對(duì)甲狀腺細(xì)胞的損傷作用誘發(fā)EAT。Tg免疫和碘過(guò)量聯(lián)合作用加重EAT的炎癥程度。
　　 3.兩品系小鼠淋巴細(xì)胞對(duì)Tg刺激的反應(yīng)不同。BALB/c小鼠細(xì)胞增殖反應(yīng)好于NOD小鼠。NOD小鼠各實(shí)驗(yàn)組Th1和Th2細(xì)胞因子在

13、互相競(jìng)爭(zhēng)抑制作用中都有所升高，但升高水平都有限；而B(niǎo)ALB/c小鼠Th1和Th2細(xì)胞因子的基礎(chǔ)水平高于NOD小鼠，并且其Th2反應(yīng)明顯強(qiáng)于Th1反應(yīng)。
　　 4.TRAIL與受體DR4或DR5結(jié)合能促進(jìn)AT甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞凋亡。TRAIL誘導(dǎo)的凋亡與炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度相關(guān)，但決定于死亡受體的表達(dá)水平，配體受體二者缺一不可。
　　 5.趨化因子CCL21及受體CCR7在促進(jìn)AT淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)中有重要作用，當(dāng)甲狀腺受到致炎因子