膽管轉(zhuǎn)分化對斑馬魚肝臟嚴重受損后的修復(fù)作用.pdf

1、肝臟是人體最大的內(nèi)臟器官，具有分泌膽汁、消化和代謝脂肪、合成和分泌氨基酸、合成和儲存糖原、儲存和過濾血液、解毒及排除廢物、分泌血清白蛋白以維持體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等多種重要功能。肝臟發(fā)揮正常生理功能是保障人口健康的基本要素之一。對于惡性肝臟疾病如肝癌，迄今為止最有效的治療和防止病情惡化的方式就是手術(shù)切除癌變部分肝臟，但是由此會導(dǎo)致患者的肝臟功能大大減弱，因此促進肝臟再生以使得受損肝臟恢復(fù)功能至關(guān)重要。與脊椎動物的其它器官相比，肝臟的再生能力較

2、強，在正常肝臟中的肝細胞雖然是靜默不分裂的，但是肝細胞卻擁有強大的分裂增殖能力并可在肝損傷后迅速進入細胞分裂周期。肝臟經(jīng)手術(shù)切除三分之二的大鼠或小鼠可在7-10天內(nèi)恢復(fù)100％的肝臟重量。當(dāng)肝臟細胞的增殖能力被抑制或者肝臟受到嚴重損傷時，一部分肝臟前體細胞會參與肝臟再生的修復(fù)，但是對這些前體細胞鑒定和分離至今尚有突破性進展。因此，建立更大程度的甚至肝臟完全損傷后再生的動物模型，對于鑒定肝臟再生過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的內(nèi)源性肝臟前體細胞并深入

3、揭示肝臟再生的分子調(diào)控機制具有重要意義。在肝臟再生過程中，成熟的膽管細胞是否會轉(zhuǎn)分化為肝臟細胞到目前為止還沒有報道，在本研究中我們主要以斑馬魚為動物模型探究肝臟嚴重受損后膽管細胞是否會轉(zhuǎn)分化為肝臟細胞來參與肝臟再生過程。
　　在本研究中，我們利用斑馬魚作為模式生物來研究肝臟再生的細胞來源和分子機制，首先我們構(gòu)建了藥物特異性誘導(dǎo)損傷肝臟細胞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚肝臟再生模型，通過大量的品系篩選和藥物優(yōu)化發(fā)現(xiàn)Mtz處理后可以使近100％的肝細

4、胞誘導(dǎo)凋亡并在撤去藥物后肝臟能夠恢復(fù)正常再生。BODIPY FL C5和糖原顯色PAS反應(yīng)實驗檢測到新生的肝臟細胞具有脂肪代謝、膽酸分泌和糖原儲存能力。因此我們構(gòu)建的斑馬魚肝臟再生模型是一種功能性的再生模型。
　　當(dāng)肝臟細胞被藥物特異性誘導(dǎo)損傷后，膽管變粗，膽管表皮細胞收縮同時有一小部分膽管細胞開始表達肝細胞的標志物，再生中后期，所有的膽管細胞都失去了正常的形態(tài)并表達肝臟特異性的分子標記，這表明膽管對肝臟再生起了重要作用。EdU標

5、記實驗發(fā)現(xiàn)新生肝臟區(qū)域出現(xiàn)大量的增殖現(xiàn)象并且這些增殖細胞主要集中在膽管中。而再生的開始階段，膽管細胞的增殖能力非常低，同時TUNEL實驗未能檢測到膽管細胞在再生過程中發(fā)生凋亡，因此膽管細胞在肝臟受損的過程中保持了完整性，這表明膽管細胞在肝臟受損后可以轉(zhuǎn)分化為肝臟細胞。為了進一步確定膽管細胞的向肝臟細胞的轉(zhuǎn)分化現(xiàn)象，我們利用Cre-Loxp系統(tǒng)來追蹤膽管來源的肝臟細胞，再生后期70％的新生肝臟細胞都來源于膽管細胞。這些現(xiàn)象表明肝臟受損再生

6、過程中，膽管細胞形態(tài)發(fā)生變化同時增殖轉(zhuǎn)分化為肝臟細胞并對肝臟再生起了主要的貢獻作用。
　　為了進一步確定膽管細胞在肝臟再生過程中的功能作用，我們在胚胎發(fā)育的早期抑制Notch信號來特異性的抑制膽管系統(tǒng)的發(fā)育，膽管系統(tǒng)發(fā)育受損的肝臟再生明顯受到抑制。同時我們利用膽管突變體證明了膽管細胞對肝臟再生的重要性。另外，在斑馬魚中用膽管毒性藥物處理早期胚胎發(fā)現(xiàn)即使對膽管微弱的毒副作用也會抑制膽管細胞向肝臟的轉(zhuǎn)分化和肝臟的正常再生。肝臟再生初期

7、膽管細胞開始表達一些內(nèi)胚層和肝臟早期的特異性標記因子，這也說明膽管細胞轉(zhuǎn)分化會伴隨一個去分化為多功能細胞的過程。
　　熒光原位雜交偶聯(lián)抗體顯色發(fā)現(xiàn)除了早期內(nèi)胚層相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子外sox9b也會在膽管細胞中上調(diào)表達，再生初期膽管細胞并未發(fā)現(xiàn)增殖現(xiàn)象但是sox9b的表達已經(jīng)上調(diào)。在sox9b突變體中，膽管細胞向肝臟細胞的轉(zhuǎn)分化受到抑制同時肝臟再生減慢，這說明sox9b對膽管細胞的轉(zhuǎn)分化具有重要作用。已有研究表明Sox9b是Notch信號

8、途徑的一個靶基因，當(dāng)抑制了Notch后肝臟再生減慢同時sox9b的表達下調(diào)。在肝臟受損的過程中，Notch的靶基因hes5在膽管中上調(diào)，這說明Notch通過介導(dǎo)sox9b來參與了膽管細胞的轉(zhuǎn)分化過程。
　　綜上所述，本研究成功構(gòu)建了斑馬魚肝臟嚴重受損模型，鑒定了與肝臟受損相關(guān)的信號機制，并首次表明斑馬魚肝臟在幾乎100％受損后，乃然可進行再生;并揭示在受損肝臟的再生修復(fù)過程中，成熟膽管細胞的轉(zhuǎn)分化起了重要作用;同時也證明膽管細胞的