食源性棕櫚酸誘導(dǎo)斑馬魚肝臟脂毒性反應(yīng)研究.pdf

1、棕櫚油，產(chǎn)量?jī)H次于大豆油，已廣泛應(yīng)用于魚類飼料中。棕桐油富含棕櫚酸，而細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的棕櫚酸積累會(huì)引起細(xì)胞功能紊亂或者細(xì)胞死亡，即脂毒性。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞模型中，高濃度棕櫚酸(250-500μM)會(huì)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡，然而棕櫚酸脂毒性在暖水魚活體及細(xì)胞水平上還未見報(bào)道。
　　本研究的第一部分利用斑馬魚建立暖水魚的棕櫚酸養(yǎng)殖模型，向斑馬魚投喂低脂(LF)，高脂(HF)以及3種添加了棕櫚酸的高脂飼料(PA4％，PA8％，PA12％)，飼喂

2、2周檢測(cè)肝臟棕櫚酸積累情況，飼喂4周檢測(cè)血清ALT、血清AST、肝臟ALT、肝臟AST、肝臟caspase-3以及Trx和Saa2 mRNA水平，作為肝臟損傷指標(biāo);檢測(cè)Grp78和Chop mRNA水平，并且通過(guò)免疫組化檢測(cè)肝臟GRP78和CHOP蛋白水平，作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)。結(jié)果顯示，肝臟棕櫚酸含量隨飼料中含量的升高而升高;與HF組相比，PA8％和PA12％組血清ALT水平分別升高了40.7％和59.5％，血清AST水平分別升高了28

3、.8％和28.0％;與HF組相比，PA12％組Grp78和Chop mRNA分別增加至2.2和2.7倍，食源性棕櫚酸誘導(dǎo)斑馬魚肝臟損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　本研究第二部建立棕櫚酸-細(xì)胞模型，研究暖水魚肝臟對(duì)棕櫚酸脂毒性的反應(yīng)機(jī)制。該部分利用RTCA實(shí)時(shí)監(jiān)控系統(tǒng)，Alarmablue活性檢測(cè)試劑檢測(cè)斑馬魚肝臟細(xì)胞活性，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)棕櫚酸對(duì)斑馬魚肝臟細(xì)胞凋亡的影響，利用qPCR檢測(cè)未折疊蛋白應(yīng)答反應(yīng)通路激活情況，并且用特異性抑制劑

4、阻斷通路激活，驗(yàn)證該通路與棕櫚酸脂毒性的聯(lián)系。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，棕櫚酸抑制斑馬魚肝臟細(xì)胞活性，誘導(dǎo)斑馬魚肝臟細(xì)胞凋亡，且未折疊蛋白應(yīng)答反應(yīng)感應(yīng)因子Grp78和Grp94 mRNA均受到棕櫚酸顯著性上調(diào)。阻斷PERK-CHOP和IRE1αt-JNK通路緩解棕櫚酸誘導(dǎo)的凋亡，阻斷ATF6通路加劇棕櫚酸誘導(dǎo)的凋亡。該部分結(jié)果表明，PERK-CHOP和IRE1α-JNK通路參與棕櫚酸對(duì)斑馬魚肝臟細(xì)胞的脂毒性。
　　本研究第三部分利用

5、斑馬魚幼魚驗(yàn)證棕櫚酸對(duì)斑馬魚肝臟的脂毒性反應(yīng)通路，向5-dpf幼魚投喂LF，HF，PA8％飼料，投喂1周，利用qPCR檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)情況及未折疊蛋白應(yīng)答反應(yīng)通路，并且根據(jù)檢測(cè)結(jié)果選擇特異性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑阻斷PERK-CHOP和ATF6通路。結(jié)果顯示，與HF組相比，PA8％組幼魚的Trx和Saa2均受到顯著性上調(diào)，Grp78、Grp94、Perk、ChopmRNA水平均較HF顯著升高，PA8％組幼魚自噬基因Bec1、Atg4b、At

6、g9a mRNA水平也受到上調(diào);抑制劑試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組(DMSO)相比，salubrinal有效抑制PA8％組幼魚PERK-CHOP通路基因表達(dá)，AEBSF有效抑制ATF6通路基因表達(dá)，salubrinal同時(shí)還下調(diào)了PA8％組幼魚自噬基因Bec1、Atg4b、Atg9a，肝臟損傷基因Saa2 mRNA水平。該部分結(jié)果表明，食源性棕櫚酸通過(guò)PERK-CHOP促凋亡通路誘導(dǎo)肝臟損傷。
　　通過(guò)研究食源性棕櫚酸對(duì)斑馬魚肝臟的負(fù)面