大豆皂甙Ba抑制棕櫚酸誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)活性及其機(jī)理研究.pdf

1、慢性非傳染性疾病(NCDs)是當(dāng)今全球致死的主要原因，給人類健康及社會(huì)發(fā)展帶來重大危害，其發(fā)生與生活方式、行為方式、職業(yè)和環(huán)境因素等有關(guān)，臨床治療效果并不是很理想，但其發(fā)生在很大程度上是可以預(yù)防的。其中炎癥是促進(jìn)NCDs發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵危害因素。
　　大豆皂甙是大豆及其制品中的一種五環(huán)三萜類植物化學(xué)物，近年來大豆皂甙的抗炎活性及其機(jī)理備受關(guān)注。本課題組前期運(yùn)用RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞體外炎癥模型對(duì)五種不同結(jié)構(gòu)的大豆皂甙(SSA

2、1、SSA2、 SS-I、SG-A和SG-B）的抗炎活性研究發(fā)現(xiàn)，SSA1、SSA2和SS-I可呈濃度依賴型的抑制NF-κB活性進(jìn)而抑制炎癥酶和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。這些研究表明大豆皂甙可能會(huì)通過調(diào)控NF-κB信號(hào)通路而發(fā)揮抗炎活性。目前有關(guān)大豆皂甙抗炎活性和機(jī)理的研究正方興未艾。
　　目的：
　　植物化學(xué)物可通過靶向調(diào)控炎癥相關(guān)信號(hào)通路抑制機(jī)體炎癥（尤其是慢性炎癥狀態(tài)）而達(dá)到防治NCDs的效果，大豆皂甙因其抗炎等多種活性在N

3、CDs防治方面具有潛在價(jià)值。SSBa是一種新提取的B組大豆皂甙單體，其抗炎活性及機(jī)制目前國內(nèi)外尚未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)首先以LPS刺激的RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞經(jīng)典體外炎癥模型為參照，運(yùn)用飽和脂肪酸棕櫚酸(PA)建立模擬體內(nèi)高游離脂肪酸炎癥狀態(tài)的體外巨噬細(xì)胞炎癥模型;進(jìn)一步運(yùn)用蛋白印跡(WB)、酶聯(lián)吸附免疫(ELISA)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(FQ-PCR)等技術(shù)研究SSBa對(duì)炎癥酶和促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響，并進(jìn)一步探討其對(duì)NF-κB

4、炎性信號(hào)通路的調(diào)控作用。旨在弄清SSBa的抗炎活性，初步闡明其抗炎機(jī)理，為合理利用大豆皂甙預(yù)防慢性炎癥介導(dǎo)的NCDs提供新的思路和理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖與毒性
　　25～500μmol/L PA對(duì)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞進(jìn)行不同時(shí)間(6、12、24、48、72 h)處理后，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，加入MTT溶液，繼續(xù)孵育4h后吸棄上清液加入DMSO，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長處的吸光度，實(shí)

5、驗(yàn)重復(fù)3次。采用SPSS軟件Probit概率單位模型計(jì)算細(xì)胞增殖半數(shù)抑制濃度(IC50)。
　　2.Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)量
　　細(xì)胞培養(yǎng)和處理:①LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥模型陽性對(duì)照組的建立:0.2～2μg/mL LPS處理6 h;0.1～1μg/mL LPS處理24 h。②PA誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥模型的建立:50～250μmol/L PA處理6h或24 h。③SSBa干預(yù)PA誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥模型:20～200μmol/

6、L SSBa對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)孵育2h，然后用250μmol/L的PA處理6h或24 h。④NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白(p65/p-p65、IκBα/p-Iκ Bα)的表達(dá)檢測(cè):50～250μmol/L PA處理;20～200μmol/L SSBa預(yù)孵育2h后250μmol/L的PA處理30 min。收集細(xì)胞后提取樣品總蛋白，測(cè)定蛋白濃度后用PBS和5×SDSLoading Buffer按所需濃度稀釋樣品蛋白，加熱蛋白變性后進(jìn)行SDS-PAG

7、E電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體孵育與顯影，得到的蛋白條帶使用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。
　　3.FQ-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)
　　細(xì)胞的培養(yǎng)和處理:①LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥模型陽性對(duì)照組的建立:0.2～2μg/mL LPS處理6 h;0.1～1μg/mL LPS處理24 h。②PA誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥模型的建立:50～250μmol/L PA處理6h或24 h。③SSBa干預(yù)PA誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥模型:20～200μmol/L

8、 SSBa對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)孵育2h，然后用250μmol/L的PA處理6h或24 h。收集細(xì)胞后用Trizol法提取總RNA，然后對(duì)樣品中總RNA的濃度及純度進(jìn)行測(cè)定，通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，測(cè)定cDNA的濃度及純度，使用FQ-PCR試劑盒將cDNA在Real Time PCR儀上擴(kuò)增出目的基因COX-2、iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6，以β-actin作為內(nèi)參基因，采用比較C(t)值的相對(duì)定量法，根據(jù)ΔΔC

9、t計(jì)算出處理組與對(duì)照組之間目標(biāo)基因的表達(dá)差異2-ΔΔCt。
　　4.ELISA測(cè)定TNF-α濃度
　　0.2～2μg/mL LPS處理6 h;50～250μmol/L PA處理6 h;20～200μmol/L SSBa預(yù)孵育1h，然后用250μmol/L的PA處理6h。設(shè)陰性對(duì)照組。處理時(shí)間結(jié)束后收集細(xì)胞皿內(nèi)的培養(yǎng)基，離心后使用相應(yīng)試劑盒進(jìn)行ELISA測(cè)定，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算檢測(cè)樣品中的TNF-α濃度。
　　5.臺(tái)

10、盼藍(lán)計(jì)數(shù)法
　　20～200μmol/L SSBa對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理6h或24 h，載玻片上臺(tái)盼藍(lán)使用液與細(xì)胞懸液按1∶1充分混合后，3 min內(nèi)顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)藍(lán)染和未藍(lán)染的細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的相對(duì)細(xì)胞抑制率和活細(xì)胞率，采用SPSS軟件Probit概率單位模型計(jì)算細(xì)胞增殖半數(shù)抑制濃度(IC50)。
　　6.統(tǒng)計(jì)處理
　　結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(X)±SD）表示。采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS19.0分析，運(yùn)用單因素方差分析進(jìn)行多個(gè)

11、樣本均數(shù)比較，進(jìn)行分析之前先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，如果方差齊，運(yùn)用LSD法進(jìn)行組間比較;如果方差不齊，運(yùn)用Dunnett's T3法進(jìn)行組間比較。采用SPSS19.0軟件Probit Analysis概率單位模型計(jì)算細(xì)胞增殖半數(shù)抑制濃度。
　　結(jié)果：
　　1.PA對(duì)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞增殖活力的影響
　　PA對(duì)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞的增殖活力呈濃度和時(shí)間抑制效應(yīng)，PA處理RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞6、12、

12、24、48和72 h的IC50值分別為610.51、433.42、217.11、167.29和132.20μmol/L。結(jié)合WB實(shí)驗(yàn)中炎癥酶的蛋白表達(dá)情況，將PA的處理濃度設(shè)定為50～250μmol/L，處理的時(shí)間設(shè)定為6h或24 h。
　　2.SSBa對(duì)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞增殖活力的影響
　　SSBa對(duì)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞的增殖活力呈濃度和時(shí)間抑制效應(yīng)，SSBa處理RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞6h和24 h

13、的IC50值分別為4139.03μmol/L和4020.76μmol/L，表明其毒性較小。本實(shí)驗(yàn)將SSBa的干預(yù)濃度設(shè)定為20、50、100和200μmol/L，預(yù)孵育的時(shí)間為1h或2h。
　　3.LPS刺激RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞建立炎癥模型
　　0～2μg/mL的LPS刺激RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞6h或24 h，炎癥酶(COX-2和iNOS)mRNA和蛋白表達(dá)水平以及促炎細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6

14、）的mRNA表達(dá)水平均呈濃度依賴性顯著升高(P＜0.05)。LPS刺激6h后TNF-α在細(xì)胞培養(yǎng)上清中分泌量顯著升高（P＜0.01）。
　　4.PA刺激RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞建立炎癥模型
　　50～250μmol/L PA處理6h或24 h，可呈濃度依賴性顯著增加炎癥酶(COX-2和iNOS)的mRNA與蛋白表達(dá)水平（P＜0.01）、促炎細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的mRNA表達(dá)水平(P＜0.05)。P

15、A刺激6h后TNF-α在細(xì)胞培養(yǎng)上清中分泌量呈濃度依賴性顯著升高（P＜0.01）。
　　5.SSBa對(duì)PA誘導(dǎo)的RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響
　　SSBa預(yù)孵育可顯著抑制PA引起的炎癥酶（COX-2和iNOS）蛋白與mRNA表達(dá)水平以及促炎細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)mRNA表達(dá)水平的增高(P＜0.01)。SSBa預(yù)孵育可呈濃度依賴性抑制PA刺激的細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α分泌（P＜0.01）。<

16、br>　　6.SSBa對(duì)PA誘導(dǎo)的RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞中NF-κB炎性信號(hào)通路的影響
　　250μmol/L PA刺激5 min可使p65磷酸化開始增強(qiáng)，到30 min時(shí)磷酸化增至表達(dá)高峰。不同濃度PA處理30 min，p65總蛋白含量無改變（P＞0.05），但p-p65呈濃度依賴性上升(P＜0.01)。不同濃度SSBa預(yù)孵育1h，再用250μmol/LPA刺激30 min，p65總蛋白含量無顯著改變（P＞0.05），10

17、0和200μmol/L SSBa可顯著抑制PA引起的p-p65蛋白表達(dá)量增加（P＜0.05）;PA顯著抑制IκBa水平（P＜0.01），20～100μmol/L SSBa可拮抗PA引起的IκBa表達(dá)量下降(P＜0.01);PA顯著增高p-IκBa水平（P＜0.01），而50～200μmol/L SSBa可抑制p-IκBa水平（P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.以炎癥酶（iNOS和COX-2）和促炎細(xì)胞因子（TNF-α、I

18、L-1β和IL-6）作為炎癥發(fā)生發(fā)展的指標(biāo)，PA刺激RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞可建立與經(jīng)典刺激因子LPS相似的體外炎癥模型。
　　2.在PA刺激的RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞炎癥模型中，SSBa可抑制炎癥酶(iNOS和COX-2)的mRNA和蛋白表達(dá)、促炎細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）的mRNA表達(dá)以及抑制TNF-α的分泌。
　　3.在PA刺激的RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞炎癥模型中，SSBa能抑制IκBα的