生物活性透明質(zhì)酸對(duì)LPS誘導(dǎo)的人樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞炎癥應(yīng)答的作用研究.pdf

1、研究目的：機(jī)體發(fā)生膿毒血癥時(shí)，Toll樣受體4（TLR4）信號(hào)通路參與固有免疫和急性炎癥的過(guò)程。因此，通過(guò)TLR4信號(hào)通路調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，被越來(lái)越多的研究者看作是臨床上治療膿毒血癥的新方向。小分子量的透明質(zhì)酸（hyaluronic acid, HA）具有多種生物學(xué)功能，可刺激內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和新生血管的形成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，也可使損傷部位炎癥細(xì)胞聚集、釋放各種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子。然而，近年有研究者發(fā)現(xiàn)小分子量的透明質(zhì)酸可發(fā)揮抗

2、炎作用。目前，小分子量的HA在炎癥效應(yīng)中的作用尚無(wú)一致的定論，且其在炎癥反應(yīng)中的作用機(jī)制也并不十分明確。在本實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用經(jīng)透明質(zhì)酸酶PH20特殊處理的分子量為10～50 kDa的重組透明質(zhì)酸（既生物活性透明質(zhì)酸，bioactive hyaluronic acid, B-HA），觀察其對(duì)LPS刺激的人樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendritic cell, DC）和巨噬細(xì)胞炎癥應(yīng)答的影響，并探究其在炎癥應(yīng)答中的作用機(jī)制。
　　研究方法：

3、>　　1.人外周血分離培養(yǎng)的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞和THP-1細(xì)胞分化來(lái)源的巨噬細(xì)胞，經(jīng)不同濃度的B-HA預(yù)先孵育2小時(shí)，加終濃度為100ng/ml的LPS刺激4小時(shí)，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10和IFN-βmRNA表達(dá)水平。確定B-HA的最適濃度。
　　2.THP-1分化來(lái)源的巨噬細(xì)胞用最適濃度的B-HA預(yù)先保護(hù)2小時(shí)，LPS刺激不同時(shí)間（分別為2小時(shí)

4、、4小時(shí)、8小時(shí)），提取細(xì)胞總RNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10和IFN-βmRNA表達(dá)水平。
　　3.最適濃度的B-HA預(yù)先保護(hù)THP-1細(xì)胞分化來(lái)源的巨噬細(xì)胞2小時(shí)，LPS刺激8小時(shí)后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）檢測(cè)細(xì)胞因子蛋白表達(dá)水平。
　　4. B-HA預(yù)先保護(hù)THP-1細(xì)胞分化來(lái)源的巨噬細(xì)胞2小時(shí)，LPS刺激不同時(shí)間（分別為15 m

5、in、30 min、60 min），提取細(xì)胞蛋白，western blot方法測(cè)定TLR4下游信號(hào)通路NF-κB、MAPKs、和IRF-3中蛋白分子的磷酸化水平改變情況。
　　研究結(jié)果：
　　1.在THP-1細(xì)胞分化來(lái)源的巨噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，與LPS組相比，20 mg/ml B-HA不僅能抑制炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8和IFN-β的mRNA和蛋白表達(dá)水平，而且可增強(qiáng)抗炎因子IL-10的mRNA和蛋白表達(dá)水平

6、。B-HA對(duì)TLR4信號(hào)通路下游的NF-κB(IKK、IκB、p65)、MAPKs（JNK、ERK、p38）和IRF-3蛋白分子的磷酸化水平均有不同程度的抑制。
　　2.在人外周血分離培養(yǎng)的 DCs細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，不同濃度的 B-HA對(duì) LPS刺激的促炎因子（TNF-α、IL-6、IL-8）和抗炎因子（IL-10）均無(wú)明顯影響。
　　結(jié)論：
　　小分子量的B-HA能通過(guò)TLR4信號(hào)通路有效地調(diào)節(jié)人巨噬細(xì)胞中促炎因子和抗炎因