基于模式生物斑馬魚研究炎癥狀態(tài)下的異煙肼肝臟毒性作用.pdf

1、目的：1、利用無毒劑量的內(nèi)毒素（LPS）預處理引起斑馬魚產(chǎn)生炎癥反應，建立基于炎癥狀態(tài)斑馬魚的藥物肝毒性評價模型。2、確定肝損傷藥物異煙肼（INH）對斑馬魚的量-毒關系，比較INH對正常和炎癥狀態(tài)斑馬魚的肝臟毒性作用差異。3、基于炎癥狀態(tài)斑馬魚模型，研究炎癥狀態(tài)下INH的肝毒性作用特點，闡述其肝毒性作用機制。
　　方法：1、斑馬魚內(nèi)毒素炎癥模型的建立：以正常發(fā)育3 dpf（daypost-fertilization， dpf）的綠

2、色熒光標記肝臟細胞、紅色熒光標記中性粒細胞和巨噬細胞Tg系（lfabp:EGFP；lyz:DsRED2）轉基因斑馬魚為實驗對象，將不同濃度的LPS（0.025、0.05、0.1 mg/mL）以滲透方式連續(xù)給藥72 h，每24h換藥液，分別于施藥24、48、72 hpe（hour postexposure， hpe）時觀察并記錄死亡率、畸形率和體長，同時在顯微鏡下觀察斑馬魚形態(tài)變化；應用Tg系（lfabp:EGFP；lyz:DsRED2）

3、轉基因斑馬魚實時觀察不同濃度的LPS對斑馬魚紅色熒光標記的中性粒和巨噬細胞遷移聚集的變化、綠色熒光標記的肝臟形態(tài)及熒光強度的影響。通過以上實驗篩選LPS產(chǎn)生炎癥且無肝損傷的造模劑量。2、炎癥狀態(tài)下INH的肝臟毒性研究：（1）INH對正常狀態(tài)斑馬魚的量-毒關系研究。采用健康發(fā)育至3 dpf的斑馬魚，將不同濃度的INH（1、2、4、6、8、16mM）以滲透方式連續(xù)給藥72 h，每24h換藥液。分別于施藥24、48、72 hpe時記錄死亡率、

4、畸形率、體長、形態(tài)和肝臟面積及熒光強度變化，HE染色觀察斑馬魚肝組織病理改變。（2）INH對炎癥狀態(tài)斑馬魚的肝臟毒性研究。采用正常發(fā)育3 dpf的斑馬魚，應用實驗1確定的LPS染毒劑量造模，實驗分為溶劑對照組、LPS組、INH組、LPS+INH組，分別于施藥后24、48、72 hpe觀察并記錄各實驗組斑馬魚的死亡率、畸形情況、炎癥效應、肝臟形態(tài)、肝臟熒光強度和卵黃囊吸收情況，對各組斑馬魚進行藥物器官毒性評分，檢測各組斑馬魚行為學差異，測

5、定ALT和AST含量，HE染色觀察斑馬魚肝組織病理改變。3、炎癥狀態(tài)下INH的肝毒性機制研究。采用電鏡觀察各組藥物作用72 hpe時斑馬魚肝臟細胞內(nèi)細胞核、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器的變化，利用Quantitative Real-time-PCR方法檢測與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、凋亡和藥物轉運體信號通路相關因子的基因轉錄水平。
　　結果：1、0.025 mg/mL劑量的LPS可誘發(fā)斑馬魚產(chǎn)生炎癥反應，該劑量可引起明顯的中性粒和巨噬細胞聚集，但對斑

6、馬魚幼魚的形態(tài)發(fā)育和肝臟無毒性作用；大于0.05 mg/mL劑量可引起中性粒和巨噬細胞大量聚集，對斑馬魚有致畸作用，主要表現(xiàn)為斑馬魚脊柱彎曲、魚鰾缺失、生長停滯和死亡等，并且對斑馬魚有明顯的肝臟毒性作用。因此選擇0.025 mg/mL的LPS預處理幼魚構建斑馬魚內(nèi)毒素炎癥模型。2、（1）INH對斑馬魚的毒性呈劑量相關性。單用INH組，1 mM INH對斑馬魚的形態(tài)發(fā)育和肝臟均無毒性作用，2 mM INH在72 hpe時可造成斑

7、馬魚肝臟熒光面積輕微減小，4 mM INH可造成斑馬魚輕度畸形（主要表現(xiàn)為魚鰾減?。┖洼p微的肝毒性，6 mM INH對斑馬魚具有中度致畸作用，主要表現(xiàn)在腹部水腫、魚鰾減小/缺失、軀體彎曲和部分死亡等，并且可引起明顯的肝臟熒光面積減小、熒光強度減弱、肝細胞之間連接疏松，大于8 mM劑量的INH可引起斑馬魚嚴重畸形和非常顯著的肝毒性，HE染色觀察到肝細胞出現(xiàn)明顯的腫脹、輪廓不清晰和胞質(zhì)稀疏等現(xiàn)象。（2）與單用INH組比，炎癥狀態(tài)下，INH的

8、致畸作用更加明顯，行動受抑制更加嚴重，肝臟熒光面積和熒光強度顯著性降低，ALT和AST水平顯著升高，HE染色結果顯示炎癥狀態(tài)下肝細胞受損更加明顯，主要表現(xiàn)在胞核萎縮變形、胞質(zhì)溶解。3、電鏡結果顯示溶劑對照組和LPS組肝細胞結構正常，4 mM INH組顯示線粒體結構異常，線粒體嵴可見明顯腫脹、嵴斷裂或消失現(xiàn)象，LPS（0.025 mg/mL）+INH（4 mM）組，細胞核不規(guī)則，核仁消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)擴張、腫脹、斷裂和扭曲等

9、現(xiàn)象，胞質(zhì)內(nèi)甚至出現(xiàn)部分空泡結構，線粒體數(shù)量減少，且線粒體嵴斷裂、溶解現(xiàn)象比INH（4 mM）組嚴重。RT-PCR檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關因子的轉錄水平，相對于單用INH組，LPS+4 mM INH組斑馬魚Bip/GRP78、ATF6、PERK、IRE1、GRP94、CHOP轉錄水平顯著性上調(diào)，LPS+2 mM、LPS+4 mM INH組斑馬魚XBP1轉錄水平顯著性上調(diào)；RT-PCR檢測凋亡相關因子的轉錄水平，相對于單用INH組，LPS+4

10、mM INH組斑馬魚Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax、Cyt轉錄水平顯著性上調(diào)；RT-PCR檢測與藥物轉運體相關因子的轉錄水平，相對于單用INH組，LPS+4 mM INH組斑馬魚NKa、Crt1顯著性上調(diào)，而Mrp3轉錄水平下調(diào)，LPS+1 mM、LPS+4 mM INH組斑馬魚MDR1轉錄水平顯著性下調(diào)，Mrp1、Mrp2的轉錄水平呈現(xiàn)劑量依賴性下調(diào)，但與單用INH各濃度組比無顯著性差異。
　

11、　結論：1、利用LPS誘導斑馬魚產(chǎn)生炎癥的建模方法效果穩(wěn)定可靠，該方法所建立的斑馬魚炎癥模型，可更好的模擬病人的炎癥狀態(tài)，更準確的評價INH肝毒性，為炎癥狀態(tài)下藥物肝毒性機制的研究提供平臺。2、炎癥狀態(tài)下INH的肝臟毒性增強。3、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及其介導的凋亡途徑可能參與炎癥促進INH肝損傷。4、炎癥狀態(tài)下，斑馬魚藥物轉運體表達異常，提示炎癥狀態(tài)下INH肝毒性增加，可能與藥物轉運體表達異常導致INH體內(nèi)蓄積有關。本實驗研究炎癥狀態(tài)下 INH的