基于模式生物斑馬魚(yú)研究炎癥狀態(tài)下的異煙肼肝臟毒性作用.pdf

1、目的：1、利用無(wú)毒劑量的內(nèi)毒素（LPS）預(yù)處理引起斑馬魚(yú)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，建立基于炎癥狀態(tài)斑馬魚(yú)的藥物肝毒性評(píng)價(jià)模型。2、確定肝損傷藥物異煙肼（INH）對(duì)斑馬魚(yú)的量-毒關(guān)系，比較INH對(duì)正常和炎癥狀態(tài)斑馬魚(yú)的肝臟毒性作用差異。3、基于炎癥狀態(tài)斑馬魚(yú)模型，研究炎癥狀態(tài)下INH的肝毒性作用特點(diǎn)，闡述其肝毒性作用機(jī)制。
　　方法：1、斑馬魚(yú)內(nèi)毒素炎癥模型的建立：以正常發(fā)育3 dpf（daypost-fertilization， dpf）的綠

2、色熒光標(biāo)記肝臟細(xì)胞、紅色熒光標(biāo)記中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞Tg系（lfabp:EGFP；lyz:DsRED2）轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將不同濃度的LPS（0.025、0.05、0.1 mg/mL）以滲透方式連續(xù)給藥72 h，每24h換藥液，分別于施藥24、48、72 hpe（hour postexposure， hpe）時(shí)觀察并記錄死亡率、畸形率和體長(zhǎng)，同時(shí)在顯微鏡下觀察斑馬魚(yú)形態(tài)變化；應(yīng)用Tg系（lfabp:EGFP；lyz:DsRED2）

3、轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)實(shí)時(shí)觀察不同濃度的LPS對(duì)斑馬魚(yú)紅色熒光標(biāo)記的中性粒和巨噬細(xì)胞遷移聚集的變化、綠色熒光標(biāo)記的肝臟形態(tài)及熒光強(qiáng)度的影響。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)篩選LPS產(chǎn)生炎癥且無(wú)肝損傷的造模劑量。2、炎癥狀態(tài)下INH的肝臟毒性研究：（1）INH對(duì)正常狀態(tài)斑馬魚(yú)的量-毒關(guān)系研究。采用健康發(fā)育至3 dpf的斑馬魚(yú)，將不同濃度的INH（1、2、4、6、8、16mM）以滲透方式連續(xù)給藥72 h，每24h換藥液。分別于施藥24、48、72 hpe時(shí)記錄死亡率、

4、畸形率、體長(zhǎng)、形態(tài)和肝臟面積及熒光強(qiáng)度變化，HE染色觀察斑馬魚(yú)肝組織病理改變。（2）INH對(duì)炎癥狀態(tài)斑馬魚(yú)的肝臟毒性研究。采用正常發(fā)育3 dpf的斑馬魚(yú)，應(yīng)用實(shí)驗(yàn)1確定的LPS染毒劑量造模，實(shí)驗(yàn)分為溶劑對(duì)照組、LPS組、INH組、LPS+INH組，分別于施藥后24、48、72 hpe觀察并記錄各實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)的死亡率、畸形情況、炎癥效應(yīng)、肝臟形態(tài)、肝臟熒光強(qiáng)度和卵黃囊吸收情況，對(duì)各組斑馬魚(yú)進(jìn)行藥物器官毒性評(píng)分，檢測(cè)各組斑馬魚(yú)行為學(xué)差異，測(cè)

5、定ALT和AST含量，HE染色觀察斑馬魚(yú)肝組織病理改變。3、炎癥狀態(tài)下INH的肝毒性機(jī)制研究。采用電鏡觀察各組藥物作用72 hpe時(shí)斑馬魚(yú)肝臟細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器的變化，利用Quantitative Real-time-PCR方法檢測(cè)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、凋亡和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體信號(hào)通路相關(guān)因子的基因轉(zhuǎn)錄水平。
　　結(jié)果：1、0.025 mg/mL劑量的LPS可誘發(fā)斑馬魚(yú)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，該劑量可引起明顯的中性粒和巨噬細(xì)胞聚集，但對(duì)斑

6、馬魚(yú)幼魚(yú)的形態(tài)發(fā)育和肝臟無(wú)毒性作用；大于0.05 mg/mL劑量可引起中性粒和巨噬細(xì)胞大量聚集，對(duì)斑馬魚(yú)有致畸作用，主要表現(xiàn)為斑馬魚(yú)脊柱彎曲、魚(yú)鰾缺失、生長(zhǎng)停滯和死亡等，并且對(duì)斑馬魚(yú)有明顯的肝臟毒性作用。因此選擇0.025 mg/mL的LPS預(yù)處理幼魚(yú)構(gòu)建斑馬魚(yú)內(nèi)毒素炎癥模型。2、（1）INH對(duì)斑馬魚(yú)的毒性呈劑量相關(guān)性。單用INH組，1 mM INH對(duì)斑馬魚(yú)的形態(tài)發(fā)育和肝臟均無(wú)毒性作用，2 mM INH在72 hpe時(shí)可造成斑

7、馬魚(yú)肝臟熒光面積輕微減小，4 mM INH可造成斑馬魚(yú)輕度畸形（主要表現(xiàn)為魚(yú)鰾減小）和輕微的肝毒性，6 mM INH對(duì)斑馬魚(yú)具有中度致畸作用，主要表現(xiàn)在腹部水腫、魚(yú)鰾減小/缺失、軀體彎曲和部分死亡等，并且可引起明顯的肝臟熒光面積減小、熒光強(qiáng)度減弱、肝細(xì)胞之間連接疏松，大于8 mM劑量的INH可引起斑馬魚(yú)嚴(yán)重畸形和非常顯著的肝毒性，HE染色觀察到肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯的腫脹、輪廓不清晰和胞質(zhì)稀疏等現(xiàn)象。（2）與單用INH組比，炎癥狀態(tài)下，INH的

8、致畸作用更加明顯，行動(dòng)受抑制更加嚴(yán)重，肝臟熒光面積和熒光強(qiáng)度顯著性降低，ALT和AST水平顯著升高，HE染色結(jié)果顯示炎癥狀態(tài)下肝細(xì)胞受損更加明顯，主要表現(xiàn)在胞核萎縮變形、胞質(zhì)溶解。3、電鏡結(jié)果顯示溶劑對(duì)照組和LPS組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，4 mM INH組顯示線粒體結(jié)構(gòu)異常，線粒體嵴可見(jiàn)明顯腫脹、嵴斷裂或消失現(xiàn)象，LPS（0.025 mg/mL）+INH（4 mM）組，細(xì)胞核不規(guī)則，核仁消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)擴(kuò)張、腫脹、斷裂和扭曲等

9、現(xiàn)象，胞質(zhì)內(nèi)甚至出現(xiàn)部分空泡結(jié)構(gòu)，線粒體數(shù)量減少，且線粒體嵴斷裂、溶解現(xiàn)象比INH（4 mM）組嚴(yán)重。RT-PCR檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄水平，相對(duì)于單用INH組，LPS+4 mM INH組斑馬魚(yú)Bip/GRP78、ATF6、PERK、IRE1、GRP94、CHOP轉(zhuǎn)錄水平顯著性上調(diào)，LPS+2 mM、LPS+4 mM INH組斑馬魚(yú)XBP1轉(zhuǎn)錄水平顯著性上調(diào)；RT-PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄水平，相對(duì)于單用INH組，LPS+4

10、mM INH組斑馬魚(yú)Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax、Cyt轉(zhuǎn)錄水平顯著性上調(diào)；RT-PCR檢測(cè)與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄水平，相對(duì)于單用INH組，LPS+4 mM INH組斑馬魚(yú)NKa、Crt1顯著性上調(diào)，而Mrp3轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，LPS+1 mM、LPS+4 mM INH組斑馬魚(yú)MDR1轉(zhuǎn)錄水平顯著性下調(diào)，Mrp1、Mrp2的轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性下調(diào)，但與單用INH各濃度組比無(wú)顯著性差異。
　

11、　結(jié)論：1、利用LPS誘導(dǎo)斑馬魚(yú)產(chǎn)生炎癥的建模方法效果穩(wěn)定可靠，該方法所建立的斑馬魚(yú)炎癥模型，可更好的模擬病人的炎癥狀態(tài)，更準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)INH肝毒性，為炎癥狀態(tài)下藥物肝毒性機(jī)制的研究提供平臺(tái)。2、炎癥狀態(tài)下INH的肝臟毒性增強(qiáng)。3、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其介導(dǎo)的凋亡途徑可能參與炎癥促進(jìn)INH肝損傷。4、炎癥狀態(tài)下，斑馬魚(yú)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)異常，提示炎癥狀態(tài)下INH肝毒性增加，可能與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)異常導(dǎo)致INH體內(nèi)蓄積有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究炎癥狀態(tài)下 INH的