HCV基因致肝臟病變的斑馬魚模型研究.pdf

1、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)是一種具有包膜的單鏈正義RNA病毒。持續(xù)性HCV感染能夠引發(fā)肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌，嚴(yán)重威脅著人類健康。目前在丙型肝炎的預(yù)防和治療中存在著一些問題，如抗HCV疫苗的研究尚未獲得突破進(jìn)展;耐藥問題嚴(yán)重，急需新型的抗HCV藥物。由于缺少穩(wěn)定可靠的HCV感染細(xì)胞模型和動物模型，人們對HCV致病機(jī)制、抗病毒藥物篩選和疫苗等方面的研究進(jìn)程受到嚴(yán)重阻礙。因此，開發(fā)新型HCV小動物模型，成為H

2、CV研究中亟待解決的一個(gè)問題。
　　 HCV蛋白的翻譯機(jī)制不同于普通的真核生物翻譯，是由其基因組5'端非編碼區(qū)的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(Internal ribosome entry site，IRES)介導(dǎo)的。IRES具有保守的二級結(jié)構(gòu)，能夠募集核糖體40S小亞基與病毒基因組RNA的結(jié)合，進(jìn)而形成翻譯起始復(fù)合物，行使啟動蛋白翻譯的功能;HCV Core蛋白作為病毒的核衣殼結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒的致病性方面具有重要作用，如導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)脂代

3、謝紊亂、參與肝細(xì)胞內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡，引發(fā)脂肪變性、肝纖維化及肝細(xì)胞癌;HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A能夠影響細(xì)胞內(nèi)多種信號傳導(dǎo)途徑，如抑制ERK MAPK途徑、抑制EGF激活的p38 MAPK途徑及激活JNK信號途徑等，并與凋亡調(diào)控因子如TNF-a、P53等相互作用，從而抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤發(fā)生。該蛋白能夠與Core結(jié)合，并共同定位于細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和脂滴，影響細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的穩(wěn)態(tài)，并共同誘導(dǎo)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激，因此，二者在HCV導(dǎo)致的病

4、理過程中，可能存在一定的相互作用。
　　 斑馬魚屬脊椎動物，其生長發(fā)育過程、組織系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與人有很高的相似性，在基因和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能上也具有較高的保守性，且具有養(yǎng)殖成本低、便于操作、繁殖能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，成為研究人類疾病發(fā)生機(jī)理的理想模式動物。由于斑馬魚肝臟的發(fā)育與人肝發(fā)育具有較大的一致性，本研究運(yùn)用基因工程技術(shù)和轉(zhuǎn)基因手段，建立了基于HCV IRES介導(dǎo)結(jié)構(gòu)蛋白Core翻譯的斑馬魚模型，并用以評價(jià)藥物在體內(nèi)的IRES抑制活性;建

5、立了一種肝特異表達(dá)的HCV NS5A表達(dá)模型，研究NS5A對于肝臟病變的作用;另外，將二者共注射，探索了Core和NS5A共同表達(dá)的斑馬魚模型，以求對NS5A和Core在肝臟病理層面的相互作用進(jìn)行探討。
　　 HCV IRES介導(dǎo)結(jié)構(gòu)蛋白Core翻譯的斑馬魚模型的建立:利用斑馬魚脂肪酸結(jié)合蛋白增強(qiáng)子與人肝脂酶啟動子序列構(gòu)建了共同調(diào)控報(bào)告基因EGFP與HCVIRES-core序列的雙順反子基因表達(dá)構(gòu)件pFL-GIC。在此基因構(gòu)件中

6、，gfp與core能夠轉(zhuǎn)錄于同條mRNA鏈，但二者在翻譯水平是獨(dú)立的，GFP蛋白的合成由通常的“帽子”結(jié)構(gòu)介導(dǎo)，而Core蛋白的合成是由IRES介導(dǎo)的。注射此基因構(gòu)件的斑馬魚幼體在熒光顯微鏡下可觀察到EGFP熒光在肝臟區(qū)域的表達(dá)。通過RT-PCR與Western-bloting的方法，證實(shí)core與gfp的表達(dá)均可隨斑馬魚幼體的發(fā)育時(shí)間而增強(qiáng)。HCV Core的表達(dá)使得斑馬魚幼體中與肝細(xì)胞脂肪代謝紊亂及纖維化相關(guān)的病理標(biāo)志基因的變化，發(fā)

7、現(xiàn)脂聯(lián)素(Adiponectin)、乙酰肝素酶(heparanase)、轉(zhuǎn)化生長因子transforming growth factor-β(TGF-β)、和瘦素受體(leptin receptor)、血小板衍生生長因子PDGF-a、PDGF-b等在注射的斑馬魚幼體的表達(dá)水平明顯升高，說明斑馬魚幼魚肝細(xì)胞已開始發(fā)生脂肪變性和纖維化。同時(shí)還檢測到與HCV感染相關(guān)的病理相關(guān)基因，如Argsyn、ScarF2、AHSG、Rasgbd、HSC7

8、0、Chemokine(1)、ETFA、LeugPCR、Erlin1等，其表達(dá)量較野生型斑馬魚均有顯著增加。這些結(jié)果表明，HCV IRES介導(dǎo)結(jié)構(gòu)蛋白Core翻譯的斑馬魚模型是成功的。用抗HCV陽性藥物利巴韋林(Ribavirin)、干擾素(IFN)、候選藥物苦參素(Oxymatrine)、類似物DM-122、輔助治療藥物維生素B12，及新型抗HBV藥物替比夫定對本模型進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，維生素B12能夠劑量依賴性抑制IRES介導(dǎo)的翻譯

9、，苦參素和DM-122具有較弱的抑制活性，替比夫定能夠同時(shí)抑制core和gfp的轉(zhuǎn)錄和翻譯，而對翻譯的抑制更明顯。利巴韋林與干擾素在此模型上無IRES抑制活性。這些結(jié)果初步說明該模型可以用于抗HCV候選藥物在IRES抑制活性方面的評價(jià)。
　　 HCV NS5A表達(dá)模型及NS5A與Core共同表達(dá)的斑馬魚模型的建立:構(gòu)建了由斑馬魚脂肪酸結(jié)合蛋白增強(qiáng)子與CMV啟動子共同調(diào)控NS5A和紅色熒光蛋白共表達(dá)的雙順反子基因構(gòu)件pFC-5Ai

10、R，將其單獨(dú)注射到斑馬魚受精卵后，能夠檢測到NS5A在肝臟內(nèi)的表達(dá);將pFC-5AiR與pFL-GIC共同注射斑馬魚卵后，NS5A與Core同時(shí)在肝臟表達(dá)并檢測到肝臟病變標(biāo)志基因的變化及與HCV感染相關(guān)的宿主基因的變化，發(fā)現(xiàn)Core的表達(dá)是促進(jìn)脂肪變性的主要因素，而在纖維化的某些基因的表達(dá)上，Core與NS5A具有一定的協(xié)同效應(yīng)，例如促進(jìn)TGF-β、Hsc70、Argsyn、HMGR等的表達(dá)。這些結(jié)果表明，NS5A與Core共同表達(dá)的斑